谷鐵樹，李 博，吳勇超，郝曉光，史 博，李智崗

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院放射科，河北 石家莊 050011)

肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率、病死率極高，但由于其發(fā)病隱匿，多數(shù)患者明確診斷時(shí)已經(jīng)是腫瘤中晚期,手術(shù)切除的機(jī)會(huì)少，術(shù)后復(fù)發(fā)常見(jiàn)。經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)作為中晚期肝臟惡性腫瘤的首選治療方法[1]，已在世界范圍內(nèi)獲得廣泛認(rèn)可，而栓塞劑是肝癌介入療效最主要的影響因素。碘油雖然很早就在介入治療中獲得應(yīng)用，但治療結(jié)果尚存爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為其存在容易形成側(cè)支循環(huán)、損傷正常肝質(zhì)及毒性等缺陷[2]；葡聚糖微球已廣泛應(yīng)用于肝臟惡性腫瘤、腎臟惡性腫瘤、腎上腺腫瘤、肺腫瘤、子宮良惡性腫瘤等實(shí)體腫瘤的介入治療中,可對(duì)末梢微動(dòng)脈形成可靠栓塞，不可吸收、無(wú)毒性、抗原性，已獲得很好的療效。本研究通過(guò)對(duì)比上述2種栓塞材料栓塞兔VX2肝移植瘤前后的CT灌注參數(shù)及免疫組織化學(xué)結(jié)果，比較2種材料的治療結(jié)果。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1荷瘤兔制備 新西蘭大白兔50只(補(bǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)室和編號(hào))，雌雄不限，于肝臟接種VX2瘤株細(xì)胞制備的濃度為1×105/mL的懸液。種植后14 d行CT灌注增強(qiáng)掃描確認(rèn)種植成功[3]。

1.2分組 制備成功的肝腫瘤兔50只隨機(jī)分為2組，每組25只。進(jìn)行肝臟腫瘤栓塞對(duì)照研究。

1.3CT灌注掃描及圖像后處理 將荷瘤兔全身麻醉后固定，經(jīng)兔耳緣靜脈以團(tuán)注法注入碘對(duì)比劑，對(duì)荷瘤兔肝臟行三期動(dòng)態(tài)灌注掃描，應(yīng)用肝腫瘤灌注模塊對(duì)數(shù)據(jù)后處理，將荷瘤兔的腹主動(dòng)脈與肝臟門靜脈分別設(shè)為流入的動(dòng)脈與流入的靜脈，把腫瘤明顯強(qiáng)化區(qū)域與其周圍肝實(shí)質(zhì)設(shè)成興趣區(qū)，獲得荷瘤兔肝臟腫瘤與正常肝臟實(shí)質(zhì)時(shí)間-密度曲線(time-density curve,TDC)和偽彩圖像，同時(shí)獲得腫瘤組織和周邊正常肝組織CT灌注的參數(shù)[4-6]。

1.4栓塞治療 掃描后次日，將荷瘤兔隨機(jī)分組，以1%利多卡因經(jīng)耳緣靜脈全身麻醉荷瘤兔后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，于兔右下肢股動(dòng)脈搏動(dòng)最明顯處切開皮膚肌層并分離暴露股動(dòng)脈，結(jié)扎股動(dòng)脈遠(yuǎn)端，穿刺股動(dòng)脈并留置穿刺針鞘管，隨后經(jīng)穿刺鞘管用微導(dǎo)管先后行荷瘤兔腹腔動(dòng)脈及肝固有動(dòng)脈造影，確定腫瘤供血?jiǎng)用}走行、腫瘤位置及腫瘤大小，分別以碘油及葡聚糖微球?qū)闪鐾酶文[瘤行超選擇行動(dòng)脈栓塞。術(shù)后予荷瘤兔每日慶大霉素4萬(wàn)U肌內(nèi)注射，連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

1.5栓塞治療后處理 栓塞治療后14 d對(duì)2組荷瘤兔行再次CT灌注掃描。掃描方法同1.1。掃描后處死荷瘤兔，分離完整肝臟腫瘤組織(包括腫瘤周圍的正常肝質(zhì))進(jìn)行抗CD34及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)免疫組織化學(xué)染色。

1.6觀察參數(shù)

1.6.1CT灌注掃描參數(shù) 組織血流量(blood flow,BF)、組織血容量(blood volume,BV)、肝動(dòng)脈供血分?jǐn)?shù)(hepatic arterial fraction,HAF)、肝動(dòng)脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)及門靜脈灌注量(portal vein perfusion,PVP)，肝動(dòng)脈灌注指數(shù)(hepatic arterial index，HPI)及門靜脈灌注指數(shù)(portal venous perfusion index,PPI)。

1.6.2免疫組織化學(xué)染色法 通過(guò)采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的聯(lián)酶卵白素染色法獲得肝臟腫瘤切片的VEGF與CD34染色陽(yáng)性的微血管密度(microvascular density，MVD)結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1荷瘤兔的CT灌注參數(shù)結(jié)果 進(jìn)行栓塞治療前2組荷瘤兔的肝臟腫瘤CT灌注參數(shù)BF、BV、HAF、HAP、PVP之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而進(jìn)行栓塞治療后碘油組BF、BV、HAF、HAP均大于葡聚糖微球組，碘油組PVP小于葡聚糖微球組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 CT灌注參數(shù)對(duì)比Table 1 Comparison of CT perfusion parameters

2.2免疫組織化學(xué)結(jié)果 對(duì)2組荷瘤兔栓塞后的肝臟腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示在荷瘤兔肝腫瘤周邊正常肝組織內(nèi)未見(jiàn)或僅見(jiàn)少量VEGF和CD34染色，而荷瘤兔肝臟腫瘤組織標(biāo)本活性區(qū)域內(nèi)免疫組織化學(xué)染色后VEGF和CD34的表達(dá)量，葡聚糖微球組較碘油組表達(dá)少，2組間的MVD差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1～4，表2。

Figure 1 The expression of CD34 in dextran microspheres group(SP ×200)

表2 免疫組織化學(xué)CD34、VEGF的MVD 比較Table 2 MVD comparison of CD34 and VEGF by immunohistochemistry

3 討 論

目前肝癌的介入栓塞治療仍然是不能手術(shù)的中晚期肝癌首選治療方法[1]。經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞治療的主要效果來(lái)自于肝動(dòng)脈栓塞，碘油是目前臨床上廣泛使用的栓塞劑之一，已獲得良好的效果。近年來(lái)，各種材料的微球類栓塞劑先后面試，在臨床上廣泛應(yīng)用，也取得了很好的治療效果，獲得了部分專家的認(rèn)可。而微球類栓塞劑是否具有與碘油一樣或者更佳的栓塞效果，仍是專家學(xué)者討論的熱點(diǎn)[7]。葡聚糖是一種天然非動(dòng)物來(lái)源的多糖分子，易于化學(xué)修飾，可通過(guò)化學(xué)方式制備成球狀的葡聚糖顆粒，它很難溶解于水，不溶解于酒精、乙醚等有機(jī)溶劑，能均勻地栓塞微小動(dòng)脈，是一種較理想的長(zhǎng)效末梢動(dòng)脈栓塞劑，已較多應(yīng)用在臨床腫瘤介入治療中。本研究試圖通過(guò)對(duì)2種栓塞材料栓塞前后兔肝移植瘤CT灌注參數(shù)的變化及免疫組織化學(xué)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比2種栓塞材料的栓塞效果。

3.1CT灌注參數(shù)的比較 CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)可定量分析腫瘤區(qū)域血液供應(yīng)情況，已經(jīng)在臨床上普遍用來(lái)評(píng)價(jià)肝癌介入栓塞治療的效果。李珊玫等[8]、劉璐璐等[9]研究顯示CT灌注成像可以量化評(píng)價(jià)肝臟腫瘤的血流灌注狀態(tài)，對(duì)肝癌介入治療方案的選擇及術(shù)后栓塞效果的評(píng)價(jià)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，雖然栓塞后荷瘤兔肝腫瘤內(nèi)仍然存在血流灌注，但葡聚糖微球組腫瘤內(nèi)的血液流量及肝動(dòng)脈灌注流量均低于碘油組，而荷瘤兔肝臟門靜脈的灌注量高于碘油組。這說(shuō)明應(yīng)用葡聚糖微球栓塞腫瘤供血?jiǎng)用}比應(yīng)用碘油栓塞對(duì)荷瘤兔肝臟腫瘤的血液供應(yīng)效果更加確切，而對(duì)門脈灌流量影響較碘油小。有臨床研究表明，使用碘油栓塞后腫瘤供血?jiǎng)用}后，肝癌周圍容易有側(cè)支循環(huán)建立，分析原因可能為化療藥物與油碘混懸時(shí)碘油顆粒大小不一，直徑較大碘油液滴無(wú)法進(jìn)入周圍小動(dòng)脈行末梢栓塞，后期血流沖刷導(dǎo)致部分血管再通，同時(shí)較碘油小液滴可通過(guò)肝血竇進(jìn)入門靜脈栓塞周圍正常肝組織，造成門靜脈灌注減少。葡聚糖微球表面帶有相同微電荷，球體相互排斥，不宜凝集成較大集團(tuán)引起沉淀[10]，因此可于碘對(duì)比劑與鹽水以特定比例形成的混合液中懸浮，這可以使得微球在進(jìn)行腫瘤供血?jiǎng)用}栓塞的過(guò)程中，不會(huì)因?yàn)槲⑶蜷g相互聚集形成沉淀，在栓塞過(guò)程中造成微導(dǎo)管阻塞；肝臟血竇直徑7～12 μm，毛細(xì)血管前終末微動(dòng)脈內(nèi)徑<50 μm，葡聚糖微球直徑50～500 μm，可以栓塞100 μm左右的微動(dòng)脈，有效阻止腫瘤周圍動(dòng)脈與腫瘤供血?jiǎng)用}建立側(cè)支循環(huán)的同時(shí)，卻無(wú)法通過(guò)終末微動(dòng)脈及肝血竇進(jìn)入門靜脈，栓塞周圍正常肝組織，可以更加有效地避免腫瘤患者肝臟功能的損傷以及栓塞治療術(shù)后各種介入并發(fā)癥的發(fā)生[11]。

3.22組間的免疫組織化學(xué)參數(shù)比較 臨床研究表明，腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移與腫瘤血管的生成密切相關(guān)，因此腫瘤的新生血管的情況決定了介入栓塞的效果[12-13]。林繼宗等[14]研究表明腫瘤供血?jiǎng)用}栓塞2 d以內(nèi)，碘油在腫瘤組織內(nèi)沉積覆蓋范圍最大，動(dòng)脈閉塞最完全；7 d以后腫瘤組織內(nèi)的VEGF表達(dá)開始出現(xiàn)上調(diào)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，在術(shù)后21 d達(dá)到峰值；術(shù)后7～14 d腫瘤組織內(nèi)微血管開始形成，術(shù)后21 d有小動(dòng)脈血管出現(xiàn)，28 d有明顯新血管的生成。腫瘤的血管形成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)及形成新的基底膜等步驟。在整個(gè)腫瘤血管形成期間，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間通過(guò)分泌細(xì)胞刺激因子互相影響，參與并促進(jìn)血管形成的因子種類眾多，其中VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管形成過(guò)程中發(fā)揮最重要的作用，可促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等，尤其是在低氧狀態(tài)下，其作用更加明顯[15]。CD34是一種重糖化I型跨膜蛋白，屬于唾液黏液蛋白家族成員，在各種血管源性腫瘤劑多種腫瘤間質(zhì)中小血管的表達(dá)已經(jīng)得到證實(shí)，可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。因而，VEGF與CD34是提示新生腫瘤血管的重要指標(biāo)。MVD值是一種較直觀地反映腫瘤新生血管增生情況的方法，可作為評(píng)價(jià)腫瘤血管生成程度的客觀標(biāo)準(zhǔn)，目前已獲得國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)。有研究表明，TACE術(shù)后阻斷了肝腫瘤的供血?jiǎng)用}，殘留腫瘤組織在低氧狀態(tài)下，可通過(guò)多種機(jī)制上調(diào)促血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)肝腫瘤血管的形成，與周圍建立側(cè)支循環(huán)[16]。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定2種栓塞劑栓塞荷瘤兔后肝臟腫瘤組織的VEGF與CD34表達(dá)的MVD值，顯示葡聚糖微球組栓塞后荷瘤兔肝臟腫瘤組織的VEGF與CD34的MVD表達(dá)平均值均比碘油組低。這說(shuō)明栓塞治療后前者的肝臟腫瘤新生供血血管數(shù)量較后者的少，證明前者的栓塞效果更佳。徐強(qiáng)等[17]在介入治療子宮肌瘤時(shí)表明，葡聚糖微球可在生理鹽水和等量的含碘造影劑混合液中穩(wěn)定懸浮，在子宮動(dòng)脈栓塞的過(guò)程不易阻塞微導(dǎo)管，更易進(jìn)入遠(yuǎn)端的微動(dòng)脈，從而更好抵御動(dòng)脈血流的沖刷，在末梢的微小動(dòng)脈形成穩(wěn)固的栓塞，阻斷腫瘤的血液供應(yīng)。葡聚糖微球的這種特性在本次對(duì)荷瘤兔肝腫瘤栓塞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)地非常明顯，栓塞后荷瘤兔肝腫瘤組織的免疫組織化學(xué)VEGF及CD34的MVD表達(dá)平均值均比碘油組低。

通過(guò)本次應(yīng)用2種不同栓塞劑栓塞荷瘤兔肝臟腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析結(jié)果顯示，應(yīng)用葡聚糖微球栓塞荷瘤兔肝臟腫瘤供血?jiǎng)用}后，對(duì)血流的阻斷效果要優(yōu)于碘油，栓塞后不易形成側(cè)支循環(huán)，同時(shí)栓塞對(duì)腫瘤周圍正常肝臟組織影響小，并且葡聚糖微球無(wú)抗原性及毒性，避免了因碘油毒性對(duì)肝功能的損害導(dǎo)致的碘油用量限制。由于篇幅所限，本次實(shí)驗(yàn)未對(duì)2種栓塞劑對(duì)肝功能損傷情況進(jìn)行研究，將在以后實(shí)驗(yàn)中完善。