彭文書曾胤劉聰龔婉瑩嚴亮季愛兵③

(1滇西應用技術大學普洱茶學院云南普洱665000;2普洱茶研究院云南普洱665000)

普洱咖啡香氣濃郁，口感醇厚，油脂豐富，有較愉悅的果酸味［1］。小?？Х犬a(chǎn)業(yè)是云南省發(fā)展高原特色農(nóng)業(yè)和精準扶貧的重點內(nèi)容，其中普洱市小?？Х冗m宜性最好［2-3］。鑒于咖啡在經(jīng)濟發(fā)展中的重要地位和種植過程中技術升級、創(chuàng)新的迫切要求，積極培育咖啡樹新品種無疑會推動咖啡產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展［4］。茶屬于杜鵑花目山茶科山茶屬（Camellia sinensis）多年生木本植物，而咖啡屬于龍膽目茜草科（Rubiaceae）一種多年生常綠灌木或小喬木［5］。遠緣嫁接一般指種間、屬間、科間等親緣關系較遠的植物之間的相互嫁接［6］，因此，茶與咖啡的嫁接屬于跨目遠緣嫁接。

據(jù)文獻報道，嫁接可以提高植物株型、生產(chǎn)力和抗逆性等。云南省采用嫁接技術進行茶樹選種、良種繁育、更新?lián)Q種，嫁接后茶葉產(chǎn)量增加，而且嫁接可以降低育種的時間和費用［7］。董云萍等［8］采用大粒種（查理種）為砧木、中粒種‘熱研3號’為接穗進行種間嫁接，發(fā)現(xiàn)嫁接后咖啡米的粒徑增大，而化學組分含量和杯品品質(zhì)無改變。楊維時［9］利用同屬不同種不含咖啡堿的油茶為砧木嫁接茶樹，選育低咖啡堿茶樹品種。不同嫁接技術已被廣泛運用于作物育種和品種改良。

利用嫁接技術對山茶科的優(yōu)良茶樹種和茜草科的優(yōu)良咖啡樹種進行融合，可為篩選和培育兼具茶樹和咖啡樹兩種優(yōu)良性狀的“咖啡茶”樹新品種奠定基礎。此外，由于茶葉和咖啡中也含有一些對人體健康不利的物質(zhì)，例如茶葉中含有一些導致肝毒性的物質(zhì)；而咖啡豆中含有咖啡白醇和咖啡醇可以導致血清膽固醇升高，誘發(fā)心肌梗死。通過培育“咖啡茶”新品種，可望能夠富集茶葉和咖啡中的健康元素，規(guī)避兩者的有害物質(zhì)。因此，該項目還將有利于云南茶和咖啡產(chǎn)品的優(yōu)化和升級、更新?lián)Q代。

試驗地點和材料選取可直接影響嫁接的成活率。本次試驗在云南省普洱市茶葉科學研究所（原茶樹良種場）開展，場地中的空氣相對濕度達75%。而普洱市屬于高海拔地區(qū)，光照強度大，應選用可大幅度降低光照強度的遮陰網(wǎng)。砧木取自5年生茶樹和5年生咖啡樹，接穗均為當年生春梢［10］。

1 材料與方法

1.1 材料

茶氨酸（純度99.7%，美國sigma公司）、咖啡堿標準品（國藥集團化學試劑有限公司）；萘乙酸NAA（百奧萊博）、快活林傷口愈合劑（河南中威高科技化工有限公司），咖啡樹砧木（Iron PickupCoffee）、茶接穗（C.sinensis var.assamica cv.Duanjiebaihao）。

1.2 方法

1.2.1 咖啡樹砧木嫁接茶接穗［11-12］

1.2.1.1 咖啡樹為砧木的劈接法（切接法）

2017年1月份，開展以咖啡樹為砧木嫁接茶穗試驗。選擇5年左右咖啡樹作為砧木，選擇50穗生長健壯、無病蟲害、半木質(zhì)化當年生春梢茶樹枝條為接穗。其中，30穗作為對傳統(tǒng)嫁接法嫁接，標記為A-1；10穗采用100滋g/mL NAA浸泡1 h，標記為A-1a；10穗使用植物傷口愈合劑（植物傷口愈合劑［13］即醫(yī)用膠水）涂抹，標記為A-1b，操作方法：在嫁接前，將其均勻涂抹在接穗及砧木楔面上。

2018年采用異穗并接法和組織黏膠粘合法試驗，以茶樹40穗枝條為接穗，其中，10穗采用異穗并接法嫁接，標記為B-1；10穗用組織黏膠異穗并接法，標記為B-1a；10穗使用單穗嫁接法，標記為B-2；10穗使用醫(yī)用組織膠單穗嫁接法，標記為B-1c。

2019年汲取了上兩年的經(jīng)驗并查閱大量文獻資料后，采用傳統(tǒng)法、同株不同穗套袋法和植物生長激素（NAA、IAA）處理法進行嫁接試驗，以茶樹180穗枝條為接穗。傳統(tǒng)方法記為C-1，同株不同穗法標記為D-1，同株不同穗套袋法標記為t，用生長激素NAA處理記為a，用生長激素IAA處理記為b?？Х日枘九臃ㄒ妶D1。

圖1咖啡砧木劈接法

1.2.1.2 咖啡樹為砧木芽接法

2017年將傳統(tǒng)芽接法標記為A-2；用100滋g/mL NAA浸泡1 h，標記為A-2a；10穗使用植物傷口愈合劑涂抹，標記為A-2b。2018年芽接法的處理：10穗采用異穗并接法嫁接，標記為B-2；10穗采用組織黏膠異穗并接法粘合法，標記為B-2a；10穗使用單穗嫁接法，標記為B-2b；10穗使用醫(yī)用組織膠單穗嫁接法，標記為B-2c。2019年傳統(tǒng)方法標記為C-2，同株不同穗法標記為D-2，同株不同穗套袋法標記為t，用生長激素NAA處理標記為a，用生長激素IAA處理標記為b?？Х日枘狙拷臃ㄒ妶D2。

1.2.1.3 咖啡嫁接咖啡

2017年至2019年3年間都利用5年左右咖啡樹為砧木，咖啡樹枝芽為接穗，采用劈接法（切接法）標記為E-1，芽接法標記為E-2，各嫁接10穗，作為對照實驗。

1.2.2 靠接［14］

1.2.2.1 咖啡與茶樹靠接

圖2咖啡砧木芽接

用5年以上根系發(fā)達、粗度基本一致的短節(jié)白毫和鐵皮卡作為靠接材料，每處理各設置5株樹（后5個處理均是靠接2株）。劈接法（切接法）標記為D-1，芽接法標記為D-2，各嫁接10穗，作為對照實驗。靠接20 d后檢查其成活率，如未成活及時補接?？Х扰c茶樹靠接見圖3。

圖3茶樹與咖啡靠接

1.2.2.2 靠接茶樹葉片和咖啡葉片茶多酚和咖啡堿含量的測定［15］

待靠接嫁接完全愈合后，再把砧木的上部和接穗的下部剪去，生長1年后，采摘6年生長葉齡的咖啡和茶的鮮葉，萎調(diào)24 h，微波殺青5 min，60℃烘干制成綠茶；制樣，采用高效液相色譜法（HPLC）分別測定茶穗、咖啡穗、茶對照組和咖啡對照組中茶多酚和咖啡堿的含量。

2 結果與分析

2.1 劈接法對茶樹（接穗）∕咖啡（砧木）嫁接組合成活率的影響

2017年選擇50穗茶樹枝條為接穗，試驗結果見表1。以咖啡作為砧木、茶樹枝條作為接穗，用傳統(tǒng)劈接法進行嫁接時，最長存活時間僅為72 d，此時存活率為3%。使用植物生長激素（NAA）浸泡的接穗最長僅存活37 d，此時存活率為20%。而使用傷口愈合劑的穗條存活時間較短，22 d時均死亡。

表1 2017年茶樹（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率

2018年茶樹（接穗）與咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率見表2。以咖啡作為砧木、茶樹枝條為接穗，采用異穗并接法進行嫁接，有3穗存活82 d；單穗嫁接法嫁接的10穗中，存活94 d的有2穗；使用醫(yī)用組織膠單穗嫁接法的10穗存活率最低，存活時間最短，異穗并接法（組織黏膠）次之。

表2 2018年茶樹（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率

2019年茶樹（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率見表3。傳統(tǒng)方法＋同株不同穗套袋法嫁接中有1穗存活至214 d，存活時間最長；其次是傳統(tǒng)方法＋同株不同穗法套袋法＋NAA嫁接、傳統(tǒng)方法＋同株不同穗套袋法＋IAA，均有1穗存活至163 d；再次是傳統(tǒng)方法＋NAA、傳統(tǒng)方法＋IAA，均有1穗存活至101 d；嫁接效果最差是傳統(tǒng)嫁接法，僅有2穗存活至81 d。

表3 2019年茶樹（接穗）/咖啡（砧木）嫁接組合劈接法成活率

2.2 芽接法對茶樹（接穗）∕咖啡（砧木）嫁接組合成活率的影響

2017年芽接法與穗接法處理相同，試驗結果見表4。以咖啡作為砧木、茶樹枝條作為接穗進行芽接法時，傳統(tǒng)芽接法的存活時間最長，5穗存活至171 d，此時存活率為50%；其次是植物生長激素浸泡（NAA，100滋g/mL，1 h）的芽接法，有1穗存活至141 d，此時存活率為10%；嫁接效果最差的是植物傷口愈合劑涂抹法，嫁接50 d時即全部死亡。

表4 2017年茶咖互嫁試驗咖啡砧木芽接法成活率

2018年茶咖嫁接咖啡砧木芽接法成活率見表5。以咖啡作為砧木、茶樹枝條作為接穗進行芽接法時，使用單穗嫁接法的存活時間最長，有2穗存活至130 d，此時存活率為20%；其次是異穗并接法，第100天時存活率為20%，此時組織黏膠異穗并接法粘合法和醫(yī)用組織膠單穗嫁接法的存活率均為10%。

表5 2018年茶咖互嫁試驗咖啡砧木芽接法成活率

2.3 咖啡嫁接咖啡對成活率的影響

咖啡互嫁劈接法和芽接法成活率見表6?？Х然ゼ拗?，芽接法也僅存活了2個月，劈接法目前有3穗已經(jīng)存活至7個月，且已經(jīng)長出新枝。由此可見，芽接法在咖啡互相嫁接中不易存活，應適當改進嫁接方法。

表6咖啡互嫁劈接法和芽接法成活率

2.4 靠接法對茶咖互嫁成活率的影響

靠接法，即接穗并不從母體上剪截下來，而是將用作接穗的植株種在砧木的近旁，把莖干互相靠攏起來進行嫁接，待接穗和砧木完全愈合后再把砧木的上部和接穗的下部剪去。試驗采用二年生茶樹和二年生咖啡幼苗三七對間植（圖3），在同等位置分別切出傷口，然后將茶樹和咖啡互相綁結在一起，由于接穗在嫁接時都未脫離母體，目前茶樹和咖啡都是存活狀態(tài)，但未見傷口愈合。

2.5 茶樹與咖啡靠接對茶多酚與咖啡堿的影響

茶多酚在茶樹無嫁接（即茶CK）和咖啡無嫁接（咖啡CK）中的含量相近，分別是18和17.8 mg/g；而在咖啡為砧木嫁接茶穗（即茶穗）中的含量為10.8 mg/g（圖4），比在咖啡為砧木嫁接咖啡穗（即咖啡穗）中的含量（15 mg/g）低。茶CK咖啡堿含量為3 mg/g，高于咖啡CK的含量（1.3 mg/g）；茶穗咖啡堿含量為1.6 mg/g，與咖啡穗（1.2 mg/g）相差不多。茶穗嫁接法見圖5。

圖4茶樹與咖啡靠接對茶多酚與咖啡堿的影響

圖5茶樹、咖啡樹嫁接圖

2.6 靠接后茶樹與咖啡細胞形態(tài)差別

2.6.1 嫁接顯微結構

參考陳軍亮等［16-17］的方法，將茶樹、咖啡樹木質(zhì)化莖做成石蠟切片（圖6），對與嫁接有關的結構進行了比較，結果表明兩者的形成層在形態(tài)學上差異較大。將茶樹與咖啡的嫩莖制成石蠟切片（圖7～8），結果表明兩者在分生組織處的結構差異較大。遠緣嫁接的新生嫩莖比原生嫩莖的細胞強度差，細胞腔間隙大；嫁接點部位的薄壁細胞分裂形成大量愈傷組織，通過愈傷組織的形成，使砧木與接穗在接口處愈合；接入砧木內(nèi)的接穗部分，外圍的薄壁組織恢復分裂，形成大量的增生組織。

圖6茶樹、咖啡樹木質(zhì)化莖做成石蠟切片

茶樹的分生組織出現(xiàn)在單側，而咖啡的分生組織是對稱生長（圖9～10）。茶樹嫩莖的形成層變化過程是由圓形變成葫蘆型，然后長成橢圓形；咖啡形成層變化過程是由紡錘形過度成橢圓形，再形成啞鈴型。這是由于茶樹葉片或花芽是互生生長，咖啡葉片或花芽是對生生長，這就造成兩者形成分生組織方式有所差異。

圖7咖啡嫩葉石蠟切片100X

圖8咖啡嫩莖石蠟切片100X

2.6.2 靠接后茶樹和咖啡嫩莖的亞顯微結構

圖9靠接莖冷凍切片（左為咖啡莖，右為茶樹莖）

圖10靠接莖愈合點冷凍切片（左為茶樹，右為咖啡樹）

電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，咖啡嫩莖（圖11）表面有少量類似臘質(zhì)物質(zhì)覆蓋，而茶樹嫩莖則無；但茶樹嫩莖表面（圖12）有大量長度大約100～200滋m的茸毛細胞，咖啡嫩莖表面光滑。亞顯微結構顯示，茶與咖啡的形成層厚度有較大差異，觀察2種植物的導管（圖13～14）發(fā)現(xiàn)，茶樹與咖啡樹的導管組織在亞顯微結構中都呈螺紋狀。

圖11咖啡嫩莖表皮冷凍電鏡

圖12茶嫩莖表皮冷凍電鏡

圖13靠接后咖啡莖電鏡切片

圖14靠接后茶莖電鏡切片

3 討論

2017～2019年，共開展3輪次的茶樹、咖啡遠緣嫁接試驗，咖啡樹作為砧木、茶樹為接穗的劈接法，一共有10穗枝條相繼發(fā)芽，到目前為止，僅有一株保持生物活性超過10個月（2020年2月），多數(shù)都不超過6個月。芽接法均沒有出現(xiàn)發(fā)芽植株?？Х燃藿涌Х仍囼炛校?017年存活率較低，2018年無存活植株，2019年存活率都在70%以上。試驗結果表明，嫁接常與季節(jié)有關，2018年嫁接較晚，成活率低；芽接法常不如穗接法存活率高；套袋可有效提高嫁接的成活率；生長激素對嫁接的成活率有一定的影響，但在本試驗中表現(xiàn)不明顯；植物傷口愈合劑和醫(yī)用組織黏膠（膠水）對植物嫁接無影響。

植物顯微結構也表明，茶樹與咖啡樹在形態(tài)結構上有差異。本研究也對靠接試驗植株進行分離處理，結果表明，2株植物接觸面仍容易完整分離，兩者并沒有粘合，都已木質(zhì)化并各自長出愈傷組織，僅是通過外界物理作用力勉強結合在一起，兩者結合部位已出現(xiàn)畸形生長。對靠接植株葉片茶多酚進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，茶多酚在茶CK和咖啡CK中含量相近，而在咖啡為砧木嫁接茶穗（即茶穗）中含量比咖啡為砧木嫁接咖啡穗（即咖啡穗）中的含量低?？Х葔A在茶CK中含量高于咖啡CK，在茶穗和咖啡穗中含量相差不多。

嫁接是一項勞動技能，嫁接成功與否常與勞動者的操作熟練程度有很大關系。2017年嫁接存活率低可能與嫁接工人操作水平有一定相關性。2018年聘請了熟練工人嫁接，采用老枝封蠟，由于嫁接季節(jié)較晚，導致成活率也較低［18］。2019年總結了2次經(jīng)驗，當年正常嫁接的成活率約90%，遠緣嫁接新發(fā)芽植株也較多；多數(shù)新發(fā)芽植株長至二葉期時，就出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，隨后枝條又重新長出枝條，僅有一兩株能長出枝條，但不能木質(zhì)化；新長出枝條明顯出現(xiàn)干癟，與正常枝條明顯不同。

組織黏膠不僅能夠在組織液陰離子的作用下能快速聚合固化成膜，并與楔面鑲嵌緊密，牢固地保持傷口的對合狀，促進愈合，還能夠?qū)⒔M織和細菌隔離，具有抗感染和保護創(chuàng)面的作用，同時還具有組織液中陰離子的作用。

綜合3個試驗研究發(fā)現(xiàn)，茶樹與咖啡樹分屬于不同的科、目，且植物的形態(tài)結構、生理生化特點相差甚大，屬于遠緣嫁接的植物育種，其變異率比近緣嫁接高［19］，而成活率一般比較低［20］，所以，本研究到目前為止，一直未能嫁接成活，試驗具有極大的挑戰(zhàn)性。砧木和接穗不親和，不能生長愈傷組織，導致輸導組織不能聯(lián)通，生長物質(zhì)引起導管或篩管阻塞，不能進行營養(yǎng)交換。根據(jù)茶氨酸和咖啡堿的含量可以判斷茶葉的品質(zhì)［21］，從靠接后茶多酚和咖啡堿含量來看，靠接后茶多酚和咖啡堿含量均有所降低，這與靠接后植物間發(fā)生了物質(zhì)交換有關。

下一步研究應結合先進的生態(tài)學理論和技術實現(xiàn)茶與咖啡遠緣嫁接技術的突破，并對嫁接過程中出現(xiàn)的嫁接不親和情況進行分析，從分子水平上探索遠緣嫁接親和與不親和的機理，可為利用茶樹、咖啡相互嫁接選育新品種提供科學依據(jù)和技術基礎。