趙光輝 方洪楓 陳劍 陳躬國 林原 袁濱

摘要：旨在借助分子標記手段對草菇菌株進行鑒別。利用17條擴增條帶清晰、穩(wěn)定的隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）、簡單重復序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）引物對20株草菇菌株基因組DNA進行PCR擴增，分析草菇菌株的遺傳差異。結果表明，17條引物共擴增出123條清晰的DNA片段，其大小為250～2 000 bp，其中多態(tài)性片段92條，平均多態(tài)性位點占比為74.80%。DNA電泳結果表明，所有供試菌株間的DNA指紋均存在差異。

關鍵詞：草菇;菌株;分子標記;遺傳多樣性

中圖分類號：S646.1+303.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）16-0194-03

草菇[Volvariella volvacea （Bull.ex Fr.） Sing.]別稱苞腳菇、蘭花菇、麻菇、貢菇、稈菇、中國菇等，是一種喜溫、喜濕、自然發(fā)生于稻草上的草腐真菌，因而得名。草菇原產于我國熱帶及亞熱帶地區(qū)，在我國各地都有栽培。草菇栽培原料廣泛，味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富[1-4]，深受廣大消費者喜愛。草菇屬于高溫型菌類，栽培原料及栽培方式多樣化，但是由于低產、不穩(wěn)產等原因，制約了草菇的發(fā)展。真菌的鑒定方法主要有形態(tài)學方法及分子標記方法等，草菇的形態(tài)學區(qū)別不大，而分子標記鑒定可以克服形態(tài)學鑒別的不足。隨著分子生物技術的發(fā)展，如序列特征化擴增區(qū)域（sequence charactered amplified region，簡稱SCAR）簡單重復序列區(qū)間（inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR）、隨機擴增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD）、簡單重復序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）等分子標記技術已被廣泛應用到鮑魚菇、草菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、雙孢蘑菇、黑木耳、野生蘑菇等食用菌遺傳多樣性、品種鑒定和育種研究中[5-20]。ISSR、RAPD這2種分子標記技術具有簡單、快速、穩(wěn)定性強的特點，已經被廣泛用于食用菌的遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)進化等研究中。本研究對收集的20株草菇菌株進行ISSR、RAPD遺傳多樣性分析，旨在為草菇鑒定及育種提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

20株試驗菌株見表1，均保藏于福建省食用菌種質資源保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）抽提液：2% CTAB（50～100 mg/L），100 mmoL/L Tris-HCl，pH值 8.0;20 mmoL/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，簡稱EDTA）;Bio-Rad C1000 PCR儀;DYY-12型電泳儀，北京六一儀器廠;GL-20G-Ⅱ 高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 草菇菌絲體的制備

將草菇馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）試管菌種接種在PDA液體培養(yǎng)基中，35 ℃搖床培養(yǎng)8 d，收集菌絲，稱取1 g菌絲用濾紙包好，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA的提取

取1 g菌絲放入研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末，將粉末轉入7 mL離心管中，用CTAB法提取DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆茫唧w操作參考熊芳等的試驗方法[5-6]。

1.5 PCR擴增

供試的RAPD、ISSR引物序列參照江玉姬等的研究[7]。RAPD、ISSR這2種標記的PCR反應體系組分見表2。RAPD PCR程序設定如下：94 ℃預變性 7 min;94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。ISSR PCR程序設定如下：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。電泳擴增方法：取 10 μL 擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，保持160 V恒壓，電泳時間為1.5 h，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.6 聚類分析

根據(jù)電泳圖上的擴增片段進行統(tǒng)計，有相應多態(tài)性條帶的記為“1”，無相應多態(tài)性條帶的記為“0”，將統(tǒng)計形成的“0-1”數(shù)據(jù)表輸入NTSYS-PC V2.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件中，采用平均連鎖法（UPGMA）進行聚類分析，生成遺傳聚類圖。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增全模板電泳結果

選用17條擴增條帶清晰、穩(wěn)定的RAPD、ISSR引物，通過PCR擴增獲得DNA指紋圖譜（圖1、圖2）。可以看出，每個引物對不同菌株擴增得到的DNA條帶數(shù)不等，一般為3～13個，絕大多數(shù)擴增片段大小為200～2 000 bp;部分擴增產物片段為所有菌株共有，說明草菇菌株基因組的相應結合位點比較保守，該區(qū)域可作為草菇菌株物種特征遺傳信息。

2.2 PCR擴增產物的多態(tài)性分析

采用17條引物對20個草菇菌株進行遺傳多樣性分析，結果顯示，17條引物均能擴增出穩(wěn)定性強、可重復性高且多態(tài)性豐富的帶型。由表3可見，不同引物所擴增條帶的多態(tài)性頻率不同，引物S227、S380、S1010、811、864、868所擴增條帶的多態(tài)性位點頻率均達到100.00%，17條引物所擴增條帶的平均多態(tài)性頻率為73.18%。另外，由17條隨機引物擴增得到的共123個RAPD、ISSR位點中，有92個位點具有多態(tài)性，其多態(tài)性頻率為74.80%。試驗結果表明，草菇菌株之間具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 基于RAPD、ISSR的系統(tǒng)綜合聚類結果

通過NTSYS-PC聚類分析軟件分析得出，草菇菌株之間的遺傳多樣性比較豐富。此外，借助RAPD、ISSR分子標記技術可以將20株菌株完全區(qū)分開。由圖3可以看出，親緣關系較近的菌株有13號、20號;11號草菇（上海草菇）菌株與其他草菇菌株之間的親緣關系較遠。在相似系數(shù)為0.21左右處，可以將20株菌株分為13類;有11株菌株為單獨的1類，分別為1、7、8、5、10、14、15、19、18、17、11號菌株;第12類為2、9號菌株;第13類為3、4、6、16、12、13、20號菌株。

3 討論

草菇是我國重要的食用菌品種之一，屬于高溫菌，目前對草菇遺傳物質的研究尚較少。草菇是初級同宗結合的食用菌，與其他食用菌相比，其有性后代存在更加廣泛的遺傳變異。余志晟等利用RFLP、RAPD方法對國內12株草菇栽培菌株進行分析，結果表明，菌株間的平均相似系數(shù)為0.707[17];江玉姬等利用RAPD、ISSR、相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）3種分子標記對來自不同地區(qū)的74株草菇菌株進行遺傳多樣性分析，結果表明，菌株之間的相似系數(shù)范圍為0～0.79，具有較豐富的遺傳多樣性[7]。韋仕巖等借助篩選到的9個ISSR引物對17株草菇菌株基因組DNA進行了遺傳差異分析，結果表明，草菇菌株之間的相似系數(shù)為0.63～0.95[18]。

4 結論

本研究選用17條多態(tài)性高、分辨率強的RAPD、ISSR引物對收集到的20份草菇種質DNA進行擴增，結果表明，草菇RAPD、ISSR帶型表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，多態(tài)性帶型占74.80%?？梢姴莨骄曛g雖然存在差異性，但是差異較小，缺少差異性較大的資源，因此今后應加強草菇種質資源的挖掘。本研究結果為草菇菌株聚類分析及品種選育提供了分子水平的依據(jù)。

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