（武漢理工大學(xué)醫(yī)院 外科，湖北 武漢 430070）

小檗堿又稱為黃連素，是傳統(tǒng)中藥黃連的主要有效成分之一，有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿在治療腫瘤方面具有獨特的藥理學(xué)活性[1]，其對多種腫瘤細胞具有不同程度的抑制作用[2]。本研究在BALB/C 小鼠皮下種植人結(jié)腸癌HCT116 細胞，復(fù)制人結(jié)腸癌模型，選擇小檗堿作為治療藥物，與常規(guī)化療藥物氟尿嘧啶相對照，探索不同劑量的小檗堿治療結(jié)直腸癌的效應(yīng)及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌HCT116 細胞（美國模式培養(yǎng)物研究所）培養(yǎng)于10% GIBCO 胎牛血清、RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（上海博升生物科技有限公司）中，于5%二氧化碳、37℃環(huán)境下培養(yǎng)，3 d 傳代1 次。使用胰蛋白酶消化傳代細胞，選取第2 代狀態(tài)好且處于對數(shù)生長期的細胞，以1 500 r/min 離心5 min，收集細胞沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline, PBS）（北京索萊寶科技有限公司）重懸細胞，重復(fù)3 次，最后一次重懸細胞后細胞計數(shù)，使用PBS 稀釋成5.0×106個/ml 的細胞懸液，使用臺盼藍染色法在顯微鏡下檢測活細胞比率＞95%。

1.2 腫瘤細胞存活率檢測

按試劑盒要求配制MTT 溶液（北京索萊寶科技有限公司），濃度為5 mg/ml，設(shè)6 個劑量，每個劑量設(shè)3 個平行孔。每孔加入新鮮配制的含0.5 mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)基100μl，37℃環(huán)境培養(yǎng)4 h 后棄上清液，每孔加入100μl MTT 顯色液，570 nm 處波長測定吸光度值。腫瘤細胞抑制率（%）=（空白對照組吸光度值－給藥組吸光度值）/空白對照組吸光度值×100%，按照中效方程計算半數(shù)抑制濃度。

1.3 動物實驗

1.3.1 分組于揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心購買60 只10 周齡的BALB/C 雄性小鼠[生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2014-2017，使用許可證號：321000600002258]，體重24～26 g，飼養(yǎng)于SPF 級動物房，嚴格控制晝夜節(jié)律，小鼠可自由攝取食物和無菌飲用水，待小鼠適應(yīng)環(huán)境之后，隨機分為空白組（未接受模型復(fù)制及任何治療）、模型組（僅接受模型復(fù)制，而不接受任何治療）、對照組（接受模型復(fù)制及氟尿嘧啶治療）及小檗堿低劑量組、小檗堿中劑量組和小檗堿高劑量組（接受模型復(fù)制及小檗堿治療），每組10 只。

1.3.2 動物模型復(fù)制及給藥治療用微量注射器吸取HCT116 細胞懸液100μl，空白組以外的小鼠右前肢皮下注射；空白組小鼠在右前肢皮下注射100μl PBS，所有小鼠注射完成后正常飼養(yǎng)。

皮下模型復(fù)制第7 天后開始給藥，將小檗堿（純度≥98%，生產(chǎn)批號：211-195-9，上海信域生物技術(shù)有限公司）溶于DMSO 中，配制濃度為1、2 和4 mg/ml,小檗堿低、中、高劑量組按10 ml/kg 予以腹腔注射，對照組小鼠按20 mg/kg 腹腔注射氟尿嘧啶。空白組和模型組腹腔注射10 ml/kg 的生理鹽水，給藥1 次/d。每天定時記錄小鼠體重變化和小鼠狀態(tài)，連續(xù)注射14 d。在第21 天處死所有小鼠，期間記錄各組小鼠存活狀態(tài)。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 體重和存活率每7 天測量1 次小鼠體重，觀察各組小鼠體重變化，繪制小鼠體重變化趨勢圖。同時記錄各組小鼠死亡時間，繪制各組小鼠存活率曲線。

1.4.2 腫瘤大小記錄空白組外的小鼠移植腫瘤大小，長徑為a，短徑為b，計算小鼠腫瘤體積，腫瘤體積=ab2/2。

1.4.3 藥物抑瘤率稱取小鼠皮下移植腫瘤重量，計算藥物抑瘤率，抑瘤率=（模型組腫瘤重量－給藥組腫瘤重量/模型組腫瘤重量）×100%。

1.4.4 mRNA、蛋白表達水平提取小鼠移植腫瘤RNA，采用qRT-PCR 法檢測細胞凋亡相關(guān)mRNA 表達，如Caspase-9、Caspase-3。使用Western blotting檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9、Caspase-3 和Cytochrome C 的表達水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，進一步的兩兩比較用Bonferroni 法校正檢驗水準，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對結(jié)腸癌HCT116 細胞有抑制作用

小檗堿對結(jié)腸癌HCT116 細胞有抑制作用，其半數(shù)抑制濃度為（0.24±0.02）μmol/L。

2.2 小鼠體重變化情況

各組小鼠注射后的第1、7、14和21天的體重比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果如下：①不同時間點的小鼠體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=14.593，P=0.001）；②各組小鼠體重比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.012，P=0.000）；③各組小鼠體重的變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.384，P=0.004）。見表1和圖1。

表1 各組小鼠體重比較 （n=10，g，±s）

表1 各組小鼠體重比較 （n=10，g，±s）

組別 第1 天 第7 天 第14 天 第21 天空白組 23.51±0.32 23.24±0.33 23.06±0.43 23.29±0.41模型組 22.82±0.33 22.59±0.29 22.01±0.39 21.23±0.39小檗堿低劑量組22.65±0.30 22.85±0.31 22.25±0.37 21.85±0.37小檗堿中劑量組22.59±0.32 22.74±0.31 22.42±0.33 21.89±0.40小檗堿高劑量組22.20±0.31 22.52±0.30 22.69±0.36 22.65±0.35對照組 22.54±0.29 22.84±0.34 22.76±0.41 21.77±0.40

圖1 各組小鼠體重變化趨勢 （n=10，±s）

2.3 各組小鼠皮下腫瘤體積比較

各組小鼠腫瘤長徑、短徑和體積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組小鼠腫瘤長徑、短徑較模型組短，體積較模型組小。呈劑量依賴性改變，且劑量越大數(shù)值越小（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腫瘤長短徑及體積比較（n=10，±s）

表2 各組小鼠腫瘤長短徑及體積比較（n=10，±s）

注：①與模型組比較，P＜0.05；②與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05；③與對照組比較，P＜0.05。

組別 腫瘤長徑/mm 腫瘤短徑/mm 腫瘤體積/cm3模型組 15.67±2.21 12.31±2.08 1.16±0.27小檗堿低劑量組 13.43±2.72①②③10.63±2.97①②③ 0.76±0.37①②③小檗堿中劑量組 12.59±2.09①②③10.15±2.26①②③ 0.65±0.32①②③小檗堿高劑量組 11.79±1.82①③ 8.85±1.67①③ 0.57±0.21①對照組 11.65±1.33 10.05±1.47① 0.59±0.14①F 值 6.192 3.388 7.852 P 值 0.001 0.017 0.000

2.4 各組小鼠存活率比較

空白組小鼠存活率為100%，模型組小鼠為50%，小檗堿低劑量組小鼠為59%，小檗堿中劑量組小鼠為62%，小檗堿高劑量給藥組小鼠為67%，對照組小鼠為66%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.264，P=0.024）。進一步的兩兩比較，經(jīng)Bonferroni 法校正檢驗水平，模型組低于空白組（P＜0.05），小檗堿低、中和高劑量組、對照組較模型組高（P＜0.05），且給藥組小鼠存活率呈劑量依賴性改變。見圖2。

圖2 各組小鼠存活率趨勢 （n=10）

2.5 各組小鼠腫瘤重量和抑瘤率比較

各組小鼠腫瘤重量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組較模型組輕，且呈劑量依賴性。各組小鼠抑瘤率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組均具有較高的抑瘤率，小檗堿高劑量組較小檗堿低、中劑量劑量組高（P＜0.05），對照組較小檗堿低、中劑量組高（P＜0.05）。小檗堿高劑量組與對照組抑瘤率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩組抑瘤率相近。見表3。

表3 各組小鼠腫瘤重量和抑瘤率比較 （n=10，±s）

表3 各組小鼠腫瘤重量和抑瘤率比較 （n=10，±s）

組別 腫瘤重量/g 抑瘤率/%模型組 3.24±1.04 -小檗堿低劑量組 2.93±1.67①②③ 34.26±3.67②③小檗堿中劑量組 2.32±1.39①②③ 43.83±4.29②③小檗堿高劑量組 1.45±1.42①③ 50.62±4.88對照組 1.75±1.37① 49.08±4.63 F 值 2.964 28.305 P 值 0.030 0.000

2.6 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA 的相對表達量比較

各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組較模型組高。對照組與模型組腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA 的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和圖3。

表4 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達量比較 （n=10，±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達量比較 （n=10，±s）

注：①與模型組比較，P＜0.05；②與小檗堿高劑量組比較，P＜0.05；③與對照組比較，P＜0.05。

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圖3 各組小鼠腫瘤組織Caspase-9、Caspase-3 mRNA 的相對表達量比較 （n=10，±s）

2.7 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9及Caspase-3 蛋白相對表達量比較

各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），小檗堿低、中及高劑量組較模型組高。對照組與模型組腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5和圖4、5。

表5 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

表5 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

組別 Cytochrome C Caspase-9 Caspase-3模型組 0.45±0.03 0.35±0.02 0.72±0.04小檗堿低劑量組 0.70±0.04 0.52±0.03 0.81±0.06小檗堿中劑量組 0.75±0.08 0.53±0.05 0.83±0.06小檗堿高劑量組 0.95±0.10 0.50±0.04 0.79±0.05對照組 0.40±0.05 0.28±0.01 0.64±0.02 F 值 5.102 4.398 4.012 P 值 0.002 0.004 0.007

圖4 各組小鼠腫瘤組織Cytochrome C、Caspase-9及Caspase-3 蛋白表達

圖5 各組小鼠腫瘤組織中Cytochrome C、Caspase-9 及Caspase-3 蛋白相對表達量比較 （n=10，±s）

3 討論

結(jié)直腸癌作為一種難治愈、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的癌癥，在全球致死性癌癥高居前列，同時隨著我國人口老齡化和生活水平的上升，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐漸上升趨勢[3-4]。目前臨床上對于結(jié)直腸癌的治療方案主要為手術(shù)治療結(jié)合藥物放化療，5-氟尿嘧啶是目前臨床首選的結(jié)直腸癌藥物，可抑制胸腺嘧啶合成酶的活性，阻止脫氧尿苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?，干擾DNA 的合成，抑制腫瘤細胞的生長[5-8]。

本研究在小鼠皮下注射人結(jié)腸癌HCT116，復(fù)制了小鼠結(jié)腸癌移植模型，探究藥物治療作用機制。選擇傳統(tǒng)中藥小檗堿，采用不同濃度小檗堿和常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶給藥。復(fù)制模型后小鼠體重呈逐漸下降趨勢，同時對照組小鼠前2 周體重變化不大，在第3 周小鼠體重下降，這可能與化療藥物氟尿嘧啶的毒性有關(guān)，小鼠主要表現(xiàn)為蜷縮，毛發(fā)發(fā)灰，這與KUBICKA[9]的研究結(jié)果相似。小鼠造模后3 周，能夠形成皮下腫瘤，在移植腫瘤的荷瘤壓力下小鼠出現(xiàn)了不同程度的萎靡和死亡，模型組有50%的死亡率，同時小檗堿不同劑量給藥組小鼠存活率呈依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)對照組小鼠抑瘤率較高，這可能與氟尿嘧啶抑制細胞增殖腫瘤細胞生長有關(guān)。但筆者發(fā)現(xiàn)對照組小鼠存在副作用，主要表現(xiàn)為小鼠在治療后期出現(xiàn)攝食量減少和體重下降，同時出現(xiàn)蜷縮和毛色不亮，同時小檗堿呈劑量依賴性地抑制小鼠皮下腫瘤組織生長，且高劑量小檗堿給藥組的抑瘤率接近陽性對照組。

Caspase-3 是細胞凋亡過程中激活的關(guān)鍵激酶，也是細胞凋亡的效應(yīng)因子。激活的Caspase-3 可作用于PARP 底物，使其發(fā)生水解，產(chǎn)物可促進細胞骨架降解DNA[10]。而Caspase-9 可直接激活Caspase-3，形成級聯(lián)反應(yīng)，促進癌細胞發(fā)生凋亡[11]。為了探究小檗堿抑制小鼠皮下移植腫瘤生長的機制，本研究提取小鼠移植腫瘤組織的mRNA，檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白、基因表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組Caspase-9 和Caspase-3 mRNA 處于低表達水平，小檗堿給藥后能夠促進Caspase-9 和Caspase-3 mRNA 的表達，但陽性藥物氟尿嘧啶無法促其表達。檢測細胞凋亡相關(guān)蛋 白Cytochrome C、Caspase-9 和Caspase-3 的 表 達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小檗堿低、中、高劑量組中小鼠腫瘤組織Cytochrome C 蛋白水平較模型組上升，這說明腫瘤組織線粒體出現(xiàn)破損，導(dǎo)致Cytochrome C 蛋白外泄至胞漿，這可能進一步引起腫瘤細胞的凋亡，另外，小檗堿給藥后能夠誘導(dǎo)Caspase-9 和Caspase-3的表達水平上升，進一步加劇腫瘤細胞凋亡，而陽性藥物5-尿氟嘧啶不具備破壞線粒體釋放Cytochrome C 和誘導(dǎo)Caspase-9 和Caspase-3 表達的功能，這與MOGHIMIPOUR 等[12]的研究結(jié)果相似。可能的原因是5-氟尿嘧啶發(fā)揮抗腫瘤活性的主要機制是干擾腫瘤細胞DNA 的合成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿通過破壞線粒體釋放Cytochrome C，進而激活凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9和Caspase-3 的表達，誘導(dǎo)腫瘤組織發(fā)生細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤活性。