龔永媚，房子倩，徐昊，黃建華，黃克強(qiáng)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 正畸科，遼寧 錦州 121004；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 外科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000）

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，盡管全球口腔癌的發(fā)病率呈下降趨勢，但舌癌的發(fā)病率卻在增加，其在口腔腫瘤中排名第1 位[1]。目前，手術(shù)為醫(yī)治舌部腫瘤的關(guān)鍵方法，并輔助其他治療手段。但是患者聲帶被手術(shù)破壞，可能使其遭受身體和心理雙重的打擊[2]。積極尋找安全、副作用小，乃至無副作用的天然藥物，對舌癌的治療顯得十分必要。

木犀草素存于諸多類型的植物中，是一種很重要的天然藥物，在體內(nèi)外均有很有效的抗癌作用[3]?？勺鳛榭垢鞣N類型人類惡性腫瘤的抗癌劑，如肺癌[4]、乳腺癌[5]及黑色素瘤[6]。已有實(shí)驗(yàn)表明，舌癌細(xì)胞系Tca8113 的凋亡可由木犀草素的作用而發(fā)生，但是如何發(fā)生凋亡，內(nèi)在的機(jī)理尚未完全研究明確[7]。本文探索木犀草素對Tca8113 細(xì)胞凋亡和自噬的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木犀草素規(guī)格：1G（藥物濃度≥98%），分子式：C15H10O6，摩爾質(zhì)量：286.24，識別碼：491-70-3。Tca8113 細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，F(xiàn)BS（GIBCO）購于美國Invitrogen 公司，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購于北京索萊寶生物科技有限公司，MTT溶液購于美國Sigma 公司，兔抗人Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3 及β-actin 單抗，以及P62、Beclin1 購于沈陽萬類生物科技有限公司，LC3B 購于美國CST 公司，HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）抗體購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Annexin V-FITC 凋亡試劑盒購于北京四正柏生物科技有限公司，木犀草素購于南京景竹生物科技有限公司。

美國BD 公司（Verse）流式細(xì)胞檢測儀，美國Thermo 公司Multiskan FC 酶標(biāo)儀和Proteinsimple 9自動凝膠成像儀，德國BIO-RAD 公司電泳儀，德國LEICA 公司DMILLED 倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 舌癌細(xì)胞培養(yǎng)RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)Tca8113 細(xì)胞，置于37℃、5%二氧化碳環(huán)境中。每天查看細(xì)胞生長情況，培養(yǎng)基營養(yǎng)不足時及時更換，待培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞生長約90%，并且細(xì)胞狀態(tài)良好，即可傳代。

1.2.2 MTT 法檢測細(xì)胞增殖取Tca8113 細(xì)胞（8×104個/孔）接種于96 孔板中，過夜。分別加入12.5、25.0、50.0 及100.0μmol/L 木犀草素，并設(shè)空白對照組。24 h 后，現(xiàn)配20μl MTT 溶液加入孔中，4 h 后取針頭抽上清，將150μl DMSO 加入其中，輕輕用手敲板四側(cè)，使其混勻；用酶標(biāo)儀測570 nm 波長處的光密度（optical density, OD）值。抑制率（%）=（1-加藥細(xì)胞組OD 值/未加藥細(xì)胞組OD 值）×100%。

1.2.3 Hoechst33342 檢測藥物對細(xì)胞凋亡的影響取Tca8113 細(xì)胞（5×105個/孔），接種于直徑為20 mm的12 孔板中。細(xì)胞在培養(yǎng)皿底延伸開，晃動培養(yǎng)基細(xì)胞不動時，每孔加木犀草素47μmol/L，設(shè)2 個復(fù)孔，分別于6、12 及24 h 后，加入染色液作用30 min，PBS 輕輕清洗3 次，鏡下觀察實(shí)驗(yàn)的變化情況，記錄實(shí)時實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡接種2×105個/孔Tca8113 細(xì)胞，然后均勻鋪在3 個100 mm 大培養(yǎng)皿中，孵育48 h，每孔加入木犀草素47μmol/L，分別作用12、24 h 后，收集細(xì)胞在10 ml 離心管中。加入Annexin V/FITC 和PI，操作時按照說明書進(jìn)行。為確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，流式細(xì)胞儀檢測需要在1 h 內(nèi)進(jìn)行。

1.2.5 Western blotting 檢測凋亡相關(guān)蛋白配制濃度為47μmol/L 的藥液，加入培養(yǎng)Tca8113 細(xì)胞的大培養(yǎng)皿中，按照1、3、6、12 及24 h 時間點(diǎn)收集細(xì)胞（同時設(shè)定不加藥組作為對照組）。按照說明書中操作方法提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度后制樣，然后按序進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，2%封閉液封閉90 min；孵上相應(yīng)一抗。4℃冰箱，搖床過夜。將制好的二抗完全覆蓋住PVDF 膜，孵育1 h。用高敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.00 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素抑制Tca8113 細(xì)胞增殖

不同濃度木犀草素處理Tca8113 細(xì)胞。24 h 后細(xì)胞增殖抑制率分別為（4.76±0.46）%、（33.91±2.88）%、（48.61±2.81）%和（71.67±1.78）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.412，P=0.000），進(jìn)一步兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。細(xì)胞抑制率隨著濃度的增大而增高。IC50 為47μmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度的木犀草素對Tca8113 細(xì)胞增殖的影響

2.2 木犀草素對Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33342 染色后，在熒光顯微鏡下可見，未加藥組對照組細(xì)胞生長形狀規(guī)則，染色均勻，經(jīng)47μmol/L 的木犀草素作用6、12 及24 h 后，隨著時間的延長，細(xì)胞核的熒光亮度越高。見圖2。

Annexin V/FITC 和PI 雙染結(jié)果見圖3。給藥0、12 及24 h 后細(xì)胞凋亡率分別為（0.37±0.32）%、（9.51±0.56）%和（14.75±0.76）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=478.915，P=0.005），與對照組比較，12 和24 h 細(xì)胞凋亡水平升高，24 h 細(xì)胞凋亡水平高于12 h（P＜0.05）。

2.3 不同時間點(diǎn)Bax、Bcl-2 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量比較

Western bloting 結(jié)果顯示，木犀草素作用Tca8113細(xì)胞1、3、6、12 及24 h 后，Bax、Bcl-2 及Cleaved Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Bax、Cleaved Caspase-3 的表達(dá)量隨時間的延長而增加；而Bcl-2 表達(dá)量隨時間的延長而呈降低趨勢。見表1和圖4。

圖2 不同時間點(diǎn)木犀草素對Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響 （×200）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測木犀草素對Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響

表1 不同時間點(diǎn)Bax、Bcl-2 及Cleaved Caspase-3 蛋白的相對表達(dá)量比較 （±s）

表1 不同時間點(diǎn)Bax、Bcl-2 及Cleaved Caspase-3 蛋白的相對表達(dá)量比較 （±s）

蛋白 對照組 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h F 值 P 值Bax 0.84±0.08 1.02±0.07 1.09±0.05 1.35±0.09 1.73±0.02 2.06±0.03 146.414 0.000 Bcl-2 2.11±0.08 1.78±0.03 1.54±0.07 1.12±0.14 1.21±0.05 0.64±0.01 118.182 0.000 Cleaved Caspase-3 0.15±0.01 0.34±0.05 0.57±0.04 0.74±0.05 1.2±0.10 1.3±0.04 215.157 0.000

圖4 木犀草素對Tca8113 細(xì)胞Bax、Bcl-2 及Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)量的影響

2.4 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Western bloting檢測結(jié)果顯示，木犀草素作用1、3、6、12 及24 h 后，Tca8113 細(xì)胞自噬P62、Beclin1 及LC3B 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），P62、Beclin1 及LC3B 蛋白水平隨時間的延長而增加。見表2和圖5。

表2 木犀草素作用1、3、6、12 及24 h 后Tca8113 細(xì)胞自噬P62、LC3B 及Beclin1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表2 木犀草素作用1、3、6、12 及24 h 后Tca8113 細(xì)胞自噬P62、LC3B 及Beclin1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

自噬蛋白 對照組 1 h 3 h 6 h 12 h 24 h F 值 P 值P62 0.16±0.01 0.203±0.01 0.26±0.01 0.324±0.03 0.44±0.04 0.53±0.07 48.713 0.000 Beclin1 0.72±0.05 0.82±0.06 1.13±0.14 1.22±.017 1.34±0.12 1.44±0.31 20.833 0.000 LC3B 0.23±0.01 0.45±0.01 0.48±0.01 0.50±0.01 0.56±0.01 0.60±0.01 727.672 0.000

圖5 木犀草素對Tca8113 細(xì)胞自噬P62、LC3B 及Beclin1 蛋白表達(dá)量的影響

3 討論

通過純化工藝可以從多種植物中提取木犀草素。目前從植物中提純的木犀草素應(yīng)用于臨床治療各種疾病，例如炎性疾病、高血壓及各種腫瘤疾病。木犀草素可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，通過不同的信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來阻斷體外和體內(nèi)的癌癥發(fā)展[8-11]。有研究指出，木犀草素會影響舌癌細(xì)胞的活性，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡和轉(zhuǎn)移等[7]，但木犀草素抑制癌細(xì)胞的具體機(jī)制尚不清楚。

細(xì)胞凋亡和自噬是細(xì)胞程序性死亡的兩種形式。癌癥發(fā)生的標(biāo)志正是凋亡細(xì)胞死亡機(jī)制的失控[12]。影響凋亡的關(guān)鍵蛋白酶家族為Caspase。調(diào)節(jié)并控制凋亡最主要癌基因之一是Bcl-2，這是一條內(nèi)在調(diào)節(jié)途徑，而Bcl-2基因正是門戶開關(guān)，癌細(xì)胞凋亡受到限制是因?yàn)榈鞍壮霈F(xiàn)過多；內(nèi)在途徑程序開啟后，也使Bax 蛋白啟動，MOMP 受到破壞，細(xì)胞色素C 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，下游的Caspase 被激活[13-14]。Caspase 對細(xì)胞凋亡機(jī)制有十分重要的影響，其包括啟動子和終止子，其中最核心的是Caspase-3 蛋白。Caspase 作為啟動子通過自身蛋白水分解自動啟動，切斷終止子Caspase，終止子Caspase 對特定細(xì)胞參與生物化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行臨界裂解，最終導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡激活Caspase-9[15]。本實(shí)驗(yàn)通過Image J 軟件得出蛋白量值，結(jié)果顯示木犀草素作用Tca8113 細(xì)胞后，Bcl-2蛋白水平下降，Cleaved Caspase-3 與Bax 蛋白水平提高，表明木犀草素對舌癌Tca8113 細(xì)胞的凋亡作用可以通過Bcl-2、Bax 及Cleaved Caspase-3 的途徑實(shí)現(xiàn)。

自噬是一種機(jī)制，通過該機(jī)制將細(xì)胞物質(zhì)遞送至溶酶體進(jìn)行降解，從而允許細(xì)胞組分的基礎(chǔ)更新并提供能量和大分子前體。然而在癌癥中，其作用相反，并且依賴于環(huán)境，與腫瘤的產(chǎn)生和惡化密切相關(guān)，其自噬水平會升高，當(dāng)外界的情況發(fā)生變化時，細(xì)胞提高自噬程度以更好地適應(yīng)環(huán)境；而細(xì)胞凋亡就是自噬水平過度變化導(dǎo)致[16-17]。本實(shí)驗(yàn)檢測LC3B、P62 及Beclin1 蛋白的表達(dá)量，探究其在細(xì)胞中是否發(fā)生了自噬[18-20]。LC3B 和Beclin1 蛋白表達(dá)量隨自噬水平的升高而升高[21]。自噬降解通路受損時，提高P62 蛋白水平[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素增加LC3B、Beclin1及P62 蛋白表達(dá)水平，表明木犀草素可能激活細(xì)胞的自噬。

綜上所述，木犀草素作為自然界天然物質(zhì)，能夠有效抑制舌癌Tca8113 體外活性，可通過提高Bcl-2、Cleaved Caspase-3 蛋白水平，降低Bax 蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；同時伴有細(xì)胞自噬性死亡，表明木犀草素對舌癌有治療作用。本實(shí)驗(yàn)為更深層次探索木犀草素對舌癌Tca8113 細(xì)胞的影響打下很好的基礎(chǔ)。