華希瑋,謝彥海,陳紅兵

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.南昌大學食品學院,江西南昌 330047;3.南昌大學實驗動物科學中心,江西南昌 330006;4.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌 330047)

水產(chǎn)種類繁多,因其營養(yǎng)價值高而在全球被廣泛食用,但其體內(nèi)的過敏原蛋白能夠引起嚴重的過敏反應。水產(chǎn)品過敏中由甲殼類引起的過敏最為普遍[1]。而蝦類由于營養(yǎng)豐富、口感極佳,深受喜愛,故在甲殼類過敏中也有顯著貢獻[2]。常見的蝦類過敏癥狀有蕁麻疹、血管性水腫,也會影響到胃腸道及呼吸系統(tǒng),嚴重者甚至發(fā)生過敏性休克[3]。源自甲殼類的過敏原有多種,有原肌球蛋白(Tropomyosin)、精氨酸激酶(Arginine kinase)、肌球蛋白輕鏈(Myosin light chain)和肌鈣蛋白(Troponin)等,其中原肌球蛋白是主要的過敏原,通常能引起甲殼類動物之間以及甲殼類與其他無脊椎動物之間的交叉反應[4]。日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense),又稱河蝦,廣泛分布于中國等亞洲國家淡水低鹽度河口地區(qū),它被認為是中國重要的漁業(yè)資源[5]。然而,目前國內(nèi)外鮮有對日本沼蝦原肌球蛋白抗原表位的分析研究。

抗原表位是致敏蛋白中決定抗原特異性的特殊化學基團,是過敏原與抗體結(jié)合的物質(zhì)基礎。表位可根據(jù)結(jié)構分為線性表位和構象表位;也可根據(jù)其結(jié)合受體細胞分為T細胞表位與B細胞表位[6]。B細胞表位可以是線性表位或構象表位,而T細胞表位一般為線性表位。在加工過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構變化,會導致抗原表位被破壞或者被掩蓋,從而致敏性降低。一些加工方法例如酶解、超高壓等會使部分食物致敏性降低甚至消失[7]。因此,針對過敏原表位的研究對于過敏原消減技術以及開發(fā)低致敏食品尤為重要。

研究表位的方法有多種,許多傳統(tǒng)的表位鑒定方法經(jīng)費成本較高,時間也較長。生物信息學的興起拓展了對食物過敏原的研究方法,通過計算機技術與生物學數(shù)據(jù)庫的結(jié)合,對過敏原蛋白的表位、同源性、過敏原之間的交叉反應性以及過敏原刺激機體產(chǎn)生免疫應答的能力進行預測[8]。

原肌球蛋白的空間結(jié)構較簡單,多數(shù)研究認為在原肌球蛋白引起的免疫反應中起主導作用的是線性表位[9],對其抗原表位的報道也多為線性表位。因此,本研究利用生物信息學技術對日本沼蝦原肌球蛋白進行分析并預測其抗原表位,以期為基于過敏原表位靶點的檢測提供依據(jù),為針對抗原表位的過敏原性消減提供新靶標。

1 材料與方法

1.1 材料

通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/)檢索日本沼蝦原肌球蛋白的氨基酸序列(登錄號為AHJ10946.1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 日本沼蝦B細胞線性表位的預測 利用SOPMA[10](https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對日本沼蝦原肌球蛋白的二級結(jié)構進行預測。利用DNAStar軟件中Protean模塊,導入氨基酸序列,分別采用Chou-Fasman[11]法及Garnier-Robson法分析日本沼蝦原肌球蛋白的二級結(jié)構,Karplus-Schulz[12]法分析柔韌性(Flexibility),Kyte-Doolittle[13]法分析親水性(Hydrophilicity)、Emini[14]法分析表面可及性(Surface probability)、Jameson-Wolf[15]法分析抗原性指數(shù)(Antigenic index),從蛋白質(zhì)多方面性質(zhì)綜合分析預測表位。分別在BepiPred 1.0 Server[16](http://www. cbs. dtu. dk/services/BepiPred-1.0/)和ABCpred[17](http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission. html)兩個網(wǎng)站中輸入蛋白序列來預測B細胞表位。綜合分析不同方法的預測結(jié)果篩選出可能的B細胞線性表位。

1.2.2 日本沼蝦T細胞表位的預測 在SYFPEITHI[18](http://www.syfpeithi.de/)網(wǎng)站的表位預測界面選擇合適的MHC類型及肽段長度,輸入氨基酸序列提交后根據(jù)得分預測T細胞表位。應用NetMHCII 2.3 Server[19](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)與NetMHCIIpan 3.2 Server[20](http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/)兩個服務器,輸入氨基酸序列并選擇相應基因型及氨基酸長度,預測蛋白質(zhì)與MHC-Ⅱ類分子的結(jié)合能力,從而預測出T細胞表位。綜合分析幾個服務器的預測結(jié)果篩選出可能的T細胞表位。

1.2.3 日本沼蝦與其它種類原肌球蛋白序列比對 通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www. ncbi. nlm. nih.gov/protein/)檢索8種水產(chǎn)類原肌球蛋白的氨基酸序列,并利用ClustalX軟件對這些不同種間的序列進行比對。褐美對蝦(Penaeusaztecus),登錄號為AAZ76743.1;中國對蝦(Penaeuschinensis),登錄號為ADA70137.1;斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon),登錄號為AAX37288.1;南美白對蝦(Penaeusvannamei),登錄號為ACB38288.1;刀額新對蝦(Metapenaeusensis),登錄號為AAA60330.1;鋸緣青蟹(Scyllaserrata),登錄號為ABS12233.1;章魚(Octopusvulgaris),登錄號為BAE54433.1;太平洋牡蠣(Crassostreagigas),登錄號為BAH10152.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本沼蝦原肌球蛋白B細胞線性表位預測

2.1.1 二級結(jié)構的預測結(jié)果 從SOPMA對日本沼蝦原肌球蛋白的二級結(jié)構預測中發(fā)現(xiàn),該蛋白質(zhì)以α-螺旋(Alpha helix)結(jié)構為主,伴隨少許無規(guī)則卷曲(Random coil)結(jié)構(圖1A)。通過DNAStar軟件中Protean模塊中的兩種方法對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構預測(圖1B),發(fā)現(xiàn)Garnier-Robson法得到的結(jié)果與前者幾乎一致,而Chou-Fasman法結(jié)果表明還存在一小部分β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)結(jié)構。有研究表明原肌球蛋白是兩個α-螺旋多肽鏈相互纏繞形成的超螺旋結(jié)構[21]。由此可見,預測得到的二級結(jié)構與文獻報道基本一致。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構中,α-螺旋一般位于蛋白質(zhì)內(nèi)部,不易與抗體結(jié)合,β-轉(zhuǎn)角與無規(guī)則卷曲多位于蛋白質(zhì)表面,更容易與抗體結(jié)合,有較大可能成為表位[22]。因此,不能通過日本沼蝦原肌球蛋白的二級結(jié)構準確地預測出表位,而需要結(jié)合親水性、抗原指數(shù)等其他性質(zhì)綜合分析。

圖1 通過SOPMA與Protean預測的日本沼蝦原肌球蛋白的二級結(jié)構

2.1.2 基于Protean的預測結(jié)果 應用DNAStar的Protean預測蛋白質(zhì)結(jié)果如圖2所示,圖2中顯示了蛋白質(zhì)的親水性、柔韌性、抗原指數(shù)和表面可及性。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)親水性非常高,幾乎整個蛋白質(zhì)的親水指數(shù)>0,蛋白質(zhì)的親水基團多位于蛋白質(zhì)表面,更容易形成與抗體等結(jié)合的抗原表位;柔韌性分析結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)柔韌性區(qū)域較多且范圍較大,由于具有柔韌性的區(qū)域發(fā)生改變的幾率較高,容易與抗體契合,形成表位的可能性較大;從抗原指數(shù)結(jié)果而言,該蛋白質(zhì)大部分區(qū)域抗原指數(shù)>0,抗原指數(shù)較高更容易形成表位;對表面可及性進行分析,以表面可及性指數(shù)>1作為選擇標準,這些區(qū)域呈現(xiàn)于蛋白質(zhì)表面,具有與抗體結(jié)合的可能性,更易形成表位[23]。綜合考慮,預測出的日本沼蝦原肌球蛋白B細胞線性表位如表1所示。

圖2 通過Protean預測的日本沼蝦原肌球蛋白的結(jié)果

表1 通過Protean預測的日本沼蝦原肌球蛋白表位

2.1.3 基于BepiPred的預測結(jié)果 BepiPred 1.0 server采用了隱馬爾可夫模型和傾向標度法,結(jié)合氨基酸性質(zhì)進行表位預測,表位分配的分數(shù)閾值設置為默認值(0.35),得分高于0.35則被認為是可能的B細胞線性表位[22,24]。BepiPred預測日本沼蝦原肌球蛋白中所有得分高于0.35的區(qū)域序列如表2,可以發(fā)現(xiàn)預測區(qū)域平均分布在整個蛋白序列上。

表2 通過BepiPred預測的日本沼蝦原肌球蛋白表位

2.1.4 基于ABCpred的預測結(jié)果 ABCpred基于標準前饋與遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡開發(fā)[24]。運用700個 B細胞表位和700個最大長度為20的非B細胞表位的隨機肽的數(shù)據(jù)庫,在不同的輸入窗口長度和隱藏單元下對網(wǎng)絡進行了訓練和測試,經(jīng)交叉驗證,結(jié)果顯示遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡及窗口長度為16時準確度達到65.93%[17]。選擇16個氨基酸的長度以及閾值0.7作為標準來篩選表位。預測的B細胞表位根據(jù)訓練后的遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡得到的分數(shù)進行排序,肽得分越高,作為表位的概率越高。所有得分高于閾值的肽排列如表3。

表3 通過ABCpred預測的日本沼蝦原肌球蛋白表位

2.1.5 綜合分析B細胞線性表位 B細胞線性表位預測通常是依據(jù)氨基酸序列信息,分析二級結(jié)構、親水性、柔韌性、表面可及性、序列保守性、殘基失序等,利用機器學習方法對Bcipep、AntiJen等數(shù)據(jù)集進行訓練,將蛋白質(zhì)的氨基酸序列輸入模型中進行鑒定[24-25]。綜合Protean、BepiPred以及ABCpred的預測結(jié)果,將重復區(qū)域作為潛在抗原表位,得到了共有的10個潛在B細胞線性抗原表位,分別是21RADTLEQQNKEANN34、37EKTEEEIRTTQKKMQQ52、71LEEKEKA77、99LERSEERLN107、119AADESER125、134SLSDEER140、158ADRKYDE164、177ERAEERAETG186、210SEEKANQREEAYKE223、262NEKEKYK268。此前已有一些研究利用生物信息學預測得到相應的B細胞線性表位并進行了驗證。李雪嬌等[26]利用生物信息學軟件DNAStar中的Protean預測出4個CM16的B細胞線性表位,與來自CM16的3條抗消化肽段的序列進行比對分析后,發(fā)現(xiàn)與其中2條肽段存在部分重合。Fu等[27]利用多種免疫信息學工具綜合預測得到中國對蝦原肌球蛋白與精氨酸激酶的線性表位后用Fmoc法固相合成多肽,經(jīng)間接競爭ELISA驗證,準確率分別高達83%與70%。由此可見,利用生物信息學預測B細胞線性表位具有一定的可行性與可靠性。不過,這些方法也存在一定的局限性。表位預測工具使用的數(shù)據(jù)集不夠完善導致預測結(jié)果不夠精準,不同工具使用的算法與模型也不盡相同,致使預測結(jié)果存在一定差異,因此均不能得出標準的預測結(jié)果[24]。雖然綜合分析不同方法的預測結(jié)果可以提高預測的準確率,但還是需要實驗進一步驗證。目前較為常見的方法是將預測的表位合成多肽后與過敏患者血清采用Dot-blot等方法進行初步鑒定[27-28]。

2.2 日本沼蝦原肌球蛋白T細胞表位的預測

2.2.1 基于SYFPEITHI的預測結(jié)果 SYFPEITHI為定性分析,它采用結(jié)合基序的方法對多肽與MHC-Ⅱ類分子的結(jié)合能力進行評分,用于篩選可能的T細胞表位[29]。在頁面選擇HLA-DRB1基因型以及15mers的氨基酸殘基長度,輸入序列后可以得到預測結(jié)果。若肽段得分超過25分,則認為其與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合力較強,是潛在T細胞表位[30]。預測結(jié)果如表4所示。該蛋白對表中幾種基因型都表現(xiàn)出較強的結(jié)合力,其中HLA-DRB1*0401基因型預測發(fā)現(xiàn)較多的表位,因此該基因型人群對該蛋白序列表現(xiàn)出更高的敏感性。

表4 通過SYFPEITHI預測的日本沼蝦原肌球蛋白表位

2.2.2 基于NetMHCII與NetMHCIIpan的預測結(jié)果 NetMHCII和NetMHCIIpan已被證明是預測多肽與MHC-II類分子結(jié)合親和力的準確率較高的方法[31]。這兩種方法都是基于來自IEDB的數(shù)據(jù)及人工神經(jīng)網(wǎng)絡,使用NNAlign框架進行訓練的[32-33]。它們的主要區(qū)別之一是,NetMHCII是每個MHC分子的獨立網(wǎng)絡的集合,而NetMHCIIpan則包含一個單一的通用網(wǎng)絡,可以預測已知蛋白質(zhì)序列的所有MHC分子的肽結(jié)合親和力[32]。研究者開發(fā)的NetMHCIIpan-3.2與NetMHCⅡ-2.3服務器,則將NetMHCII和NetMHCIIpan預測范圍擴大并可以顯著地提高預測準確性。MHC-Ⅱ類分子能結(jié)合長度達10～28個氨基酸殘基的表位,最佳長度為12～16個氨基酸殘基[34]。因此,應用這兩個服務器,選擇中國人群中常見的HLA等位基因[35-36]以及15的肽段長度進行T細胞表位預測。Affinity(nM)<50即該肽段與MHC-II類分子結(jié)合呈強親和力,50

表5 通過NetMHCII與NetMHCIIpan預測的日本沼蝦原肌球蛋白表位

圖4 不同物種間原肌球蛋白序列比對及T細胞表位對比

2.2.3 綜合分析T細胞表位 外源性蛋白質(zhì)抗原一般經(jīng)抗原遞呈細胞處理后由MHC-Ⅱ類分子遞呈給T細胞[38]。因此,預測蛋白質(zhì)的T細胞表位可通過評估MHC-Ⅱ類分子與多肽的結(jié)合能力來實現(xiàn)。在人體中負責編碼相關分子的HLA-Ⅱ類基因主要包括DP、DQ、DR三個亞區(qū)[39]。因HLA基因組高度多態(tài)性,故選擇中國人群中常見的HLA等位基因型進行預測。綜合SYFPEITHI、NetMHCII和NetMHCIIpan的預測結(jié)果,選取重復區(qū)域作為潛在表位,得到了共有的5個潛在T細胞抗原表位,分別是82EGEVAALNRRIQLL95、105RLNTATTKLAEAS117、165VARKLAMVEADLE177、195EELRVVGNNLKSLE208、222KEQIKTLTNKLKAA235。T細胞表位預測在基礎研究中可以減少工作量,降低成本,同時,一些準確性較高的預測工具的預測結(jié)果也能得到驗證。伍慧妍等[30]利用NetMHCII預測得到牡蠣原肌球蛋白的T細胞表位,發(fā)現(xiàn)與前人經(jīng)實驗鑒定的表位幾乎一致。在目前的T細胞表位預測工具中,預測多肽與MHC-Ⅱ類分子的結(jié)合位點和結(jié)合親和力是預測與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的表位的主要方法。然而大多數(shù)方法僅考慮表位的核心結(jié)合序列,而忽略了兩側(cè)氨基酸殘基及TCR對結(jié)合力的影響[29]。因此,表位預測結(jié)果可以通過合成多肽后進行淋巴細胞增殖實驗、免疫保護實驗等來進一步驗證[38]。

2.3 日本沼蝦與不同種間原肌球蛋白序列比對

2.3.1 日本沼蝦原肌球蛋白B細胞表位對比 日本沼蝦與不同物種序列比對結(jié)果如圖3。從圖3中可以發(fā)現(xiàn)這幾種原肌球蛋白序列相似度很高,蝦蟹類之間序列相似度均高于80%,而蝦蟹類與軟體動物之間相似度為60%～80%,由此可見,原肌球蛋白具有較高的保守性。一些學者已經(jīng)鑒定出幾種水產(chǎn)原肌球蛋白的表位[27-28,40-45]。這些表位多位于保守區(qū)內(nèi),且不同種間表位有部分或完全重疊。此次預測的日本沼蝦原肌球蛋白B細胞表位也基本位于保守區(qū)內(nèi),且與已鑒定的表位均有重疊,其中預測的表位4與表位6重疊部分最多,因此該區(qū)域更有可能發(fā)生交叉反應。

圖3 不同物種間原肌球蛋白序列比對及B細胞表位對比

2.3.2 日本沼蝦原肌球蛋白T細胞表位對比 原肌球蛋白相關的T細胞表位研究不多,然而T細胞在免疫過程中也起著重要作用。Wai等[46]合成18個重疊肽,利用肽段刺激致敏小鼠中分離出的脾細胞,通過其增殖與細胞因子的反應鑒定T細胞表位。Ravkov等[47]綜合體外的MHC-肽結(jié)合實驗及體內(nèi)的增殖及細胞因子釋放實驗鑒定了17個T細胞表位。此次預測的日本沼蝦原肌球蛋白T細胞表位與已鑒定的表位均有重疊,其中表位5與鑒定表位完全一致,其他4個表位也均位于保守區(qū)。

3 結(jié)論

本研究在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中找到日本沼蝦原肌球蛋白的氨基酸序列,運用DNAStar、BepiPred和ABCpred對日本沼蝦原肌球蛋白進行B細胞線性表位預測,最終定位出潛在的B細胞線性表位有10個肽段。同時,應用SYFPEITHI、NetMHCII和NetMHCIIpan分別對序列與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合力評估,最終篩選出可能的T細胞表位有5個肽段。預測的表位與已經(jīng)鑒定的表位均有部分重疊,這可能一定程度上會導致交叉反應?？傊?本研究利用生物信息學技術預測出了日本沼蝦原肌球蛋白的B細胞線性表位及T細胞表位,將有助于對日本沼蝦過敏原的認識,為未來基于表位的相關研究提供了新的研究靶標。另外,日本沼蝦原肌球蛋白的準確的表位以及優(yōu)勢表位還有待實驗進一步確證。