曾 洪，孫文笑，鄧熠鋆，高 榕,2，陳 禮,2，方 俊,2，梁運姍,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，洞庭湖區(qū)農(nóng)村生態(tài)系統(tǒng)健康湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128;2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省豬場廢棄物無害化處理與資源化利用工程研究中心，湖南 長沙 410128)

土霉素是由龜裂鏈霉菌在機體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物，對細(xì)菌、衣原體、支原體等特異性微生物具有強力抑制作用，故在養(yǎng)殖業(yè)中常被作為飼料添加劑使用[1-2]。土霉素在提高養(yǎng)殖效率方面的巨大貢獻(xiàn)不容忽視，但畜禽動物對于土霉素的吸收并不完全，而國內(nèi)濫用土霉素、畜禽糞便不加處理直接排放的行為隨處可見[3]。有研究表明，2013年中國36種抗生素的消耗量為16.2萬t，其中有約58%的抗生素被釋放到環(huán)境中。流入環(huán)境的土霉素會對土壤微生物、植物乃至動物造成嚴(yán)重的生態(tài)毒害[4]。當(dāng)前治理國內(nèi)土霉素嚴(yán)重污染的首要任務(wù)，是控制土霉素作為飼料添加劑的添加量，使其趨于合理化；其次是通過科學(xué)的處理方法消除環(huán)境中殘留的抗生素。主流的抗生素治理方法大致為物理、化學(xué)、生物降解三種。其中生物降解具有價格低廉、方法簡單、降解效率高等優(yōu)點[5]。在現(xiàn)有的報道中，已有學(xué)者篩選得到假胞桿菌(Pseudomonassp.) ，將菌株結(jié)合堆肥實驗后土霉素去除率可達(dá)93.21%[6]；另有研究者篩選出短波單胞桿菌屬(Brevundimonassp.)和類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)，通過添加不同的氮源和碳源以及金屬離子，使菌株對土霉素的降解率分別提升到72.99%和71.04%[7]。但縱觀已有的文獻(xiàn)報道，高效降解土霉素的菌株種類仍顯不足。因此，高效土霉素降解菌的篩選對于進一步處理環(huán)境中土霉素殘留問題具有重大意義，并在環(huán)境深度修復(fù)方面存在著巨大的潛在應(yīng)用前景。本研究從湖南大型養(yǎng)殖場固體廢棄物中篩選出一株高效土霉素降解菌株，對其進行鑒定和降解性能研究，以期為高濃度土霉素環(huán)境中土霉素污染修復(fù)技術(shù)提供一定的技術(shù)支持，并為進一步高效消除殘留土霉素提供菌株資源和理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

從湖南省某大型養(yǎng)殖場內(nèi)，取一定量的新鮮豬糞、堆肥原材料和堆肥腐殖質(zhì)進行混合，置于4℃冰箱保存，作為篩菌原料。土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(C22H24N2O9·HCl，HPLC≥98%)購自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈購自德國默克制藥與化工公司，磷酸為優(yōu)級純試劑，實驗中所用水均為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl 2.5g、超純水500mL，土霉素劑量依實驗所需添加)。固體LB培養(yǎng)基(牛肉膏1.5g、蛋白胨5g、NaCl 2.5g、瓊脂9g、超純水500mL，土霉素劑量依實驗所需添加)。

篩選培養(yǎng)基((NH4)2SO42.0g，K2HPO40.05g，NaH2PO40.05g，瓊脂20g，土霉素150mg/L，超純水定容至1000mL，pH7.0～7.4)。無機鹽培養(yǎng)基( (NH4)2SO42.0g，K2HPO40.05g，NaH2PO40.05g，超純水定容至1000mL，pH調(diào)至7.0～7.4)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選

取10g篩菌原料于250mL三角瓶中，加入90mL超純水，于150r/min，32℃條件下振蕩30min。振蕩后的樣品靜置5min后，吸取1mL上清液至LB培養(yǎng)基(土霉素濃度為25mg/L)中，培養(yǎng)5d后取1mL培養(yǎng)液至新的LB培養(yǎng)基(土霉素濃度為50mg/L)，依照此方法逐漸提高土霉素濃度(土霉素濃度依次為100mg/L，150mg/L，200mg/L)。最終于土霉素濃度為200mg/L培養(yǎng)基中吸取1mL培養(yǎng)液，依照梯度稀釋法稀釋至10-7，取10-7稀釋液100μL涂布于篩選培養(yǎng)基，于37℃無菌環(huán)境下培養(yǎng)4d。取涂布得到的菌落，劃線于新的篩選培養(yǎng)基平板上，重復(fù)多次，分離純化至得到單一菌株。所得菌株于固體LB培養(yǎng)基斜面中保存。

1.2.2 菌株的鑒定

采用基因組提取試劑盒對菌株總DNA進行提取，以其為模板，采用通用引物27F和1492R對菌株16S rDNA進行擴增。PCR反應(yīng)體系：基因組DNA 0.5μL，2×Pfu Mix 12.5μL，引物27F 1μL，引物1492R 1μL，用ddH2O 補足至25μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5min，4℃保溫。將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到條帶單一、大小正確的產(chǎn)物后,將其送至上海生物工程有限公司進行測序，將所得16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行同源度比對，使用MEGA 5.0 軟件，采用Neighbor Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值為1000。

1.2.3 分析測定方法

使用高效液相色譜儀(型號G1311B，美國安捷倫公司)測定土霉素含量。取培養(yǎng)液 3mL，吸取 6mL EDTA二鈉-Mcllvaine 緩沖液，分別吸取1mL 正己烷，1mL 三氯甲烷，超聲10min，5000r/min 離心10min，上清液經(jīng) 0.45μm 微孔濾膜過濾，濾液用于 HPLC 分析。色譜條件為：色譜柱：ODS-2 HYPERSIL(250mm×4.6mm，5μm)不銹鋼柱，流動相：乙腈:KH2PO4溶液(0.05mol/L)(20∶80，V/V)，檢測器：紫外吸收檢測器，檢測波長：355nm，柱溫：25℃，流速：1mL/min，每次進樣量為 20μL(進樣閥定量)，每個處理重復(fù)3次。

1.2.4 菌株生長曲線和降解性能測定

1.2.4.1 生長曲線測定

將純化后的菌株接種到土霉素濃度為50mg/L無機鹽培養(yǎng)基中，于37℃，轉(zhuǎn)速150r/min的條件下連續(xù)培養(yǎng)10d，每間隔24h取2mL培養(yǎng)液，采用紫外分光光度計(型號UV1802G，天津冠澤科技)測定其在600nm的吸光度，使用OD600值來表示菌株的生長量，此過程去除土霉素懸濁液的背景值。

1.2.4.2 不同培養(yǎng)條件下菌株生長量和降解性能測定

將菌株接種于無機鹽培養(yǎng)基中，在初始培養(yǎng)條件(溫度37℃，pH7.0，接種量5%，轉(zhuǎn)速150r/min)下，將底物濃度分別設(shè)置為10，25，50，100，150，200mg/L5個梯度，連續(xù)培養(yǎng)10d，測試菌株在相應(yīng)條件下對土霉素的最高降解率和對應(yīng)OD600值。每個處理均設(shè)置空白對照，且重復(fù)3次。然后，在確定最佳耐受底物濃度值的前提下，依次對溫度(20，30，37，45，50℃5個梯度)、pH值(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，6個梯度)、菌株接種量(1%，3%，5%，10%，20%5個梯度)和轉(zhuǎn)速(0，70，100，140，200r/min5個梯度)條件進行考察，各參數(shù)測試過程采用上一步實驗所獲最佳條件值。降解過程均為培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

經(jīng)過富集、初篩、復(fù)篩的馴化方式，分離出一株土霉素降解菌，將其命名為OTC-1，該菌能以土霉素作為唯一碳源進行生長繁殖。光學(xué)顯微鏡觀察表明，OTC-1在培養(yǎng)基上的生長特征為表面光滑，向上凸起，較透明，粘韌性不等，有光亮色的圓形小菌落；經(jīng)革蘭氏染色后在1000倍油鏡下觀察得該菌呈紅色米粒大小的短桿狀，為革蘭氏陰性菌。將得到的16SrDNA測序結(jié)果在NCBI上進行blast比對，結(jié)果表明OTC-1的16S rDNA序列與多種克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)具有高度相似性，相似度高達(dá)99%，初步判定OTC-1為肺炎克雷伯氏菌屬。

2.2 OTC-1的生長曲線測定

在菌株連續(xù)培養(yǎng)的過程中，菌株生長的前24h，菌株OD600有小幅下降(圖3)，由最開始的0.208降低至0.196，原因可能是該菌株接入含一定量土霉素的無機鹽培養(yǎng)基后，首先進入短暫的遲緩期。24h之后，OD600值開始上升，并在第4～6d出現(xiàn)迅速上升趨勢。培養(yǎng)第6d時OD600達(dá)到最大值0.594。這表明菌株在度過遲緩期之后能迅速進入對數(shù)生長期，與已知的相關(guān)研究結(jié)果相似。當(dāng)培養(yǎng)時間超過6d時，菌株的生長量開始下降，在第6～7d時下降幅度較大。在試驗過程中觀察到隨著時間的延長培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化，由黃色到紅棕色再到紫褐色，這些顏色的變化可能是土霉素被菌利用后產(chǎn)生不同的中間代謝產(chǎn)物。有研究表明，抗生素降解過程的中間產(chǎn)物可能具有抑菌性，從而降低了微生物活性[8]。

2.3 不同培養(yǎng)條件對菌株生長及降解性能的影響

2.3.1 底物濃度對菌株生長的影響

圖4所示為不同初始底物濃度對菌株生長的影響。由圖可知，在初始土霉素濃度從10mg/L逐漸上升至200mg/L的過程中，菌株生長量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在底物濃度為10mg/L上升至100mg/L過程中，菌株生長量隨著底物濃度增加而保持上升趨勢，但上升幅度較小，由0.227上升到0.419，僅上升了0.192?？赡茉蚴潜緦嶒炓酝撩顾貫槲ㄒ惶荚?，并未添加其他碳源，而土霉素對菌株仍存在一定毒性，導(dǎo)致碳源不足以促使菌株快速繁殖[9]。當(dāng)?shù)孜餄舛葟?00mg/L增加至150mg/L時，菌株生長量出現(xiàn)大幅上升，并在150mg/L底物條件下OD600值達(dá)到最大值0.589。底物增大至200mg/L時，OD600值最大僅0.451，這表明菌株在底物濃度為200mg/L時大量死亡。即高濃度的土霉素對微生物的活性產(chǎn)生了強烈的抑制作用，影響到菌株的生長代謝，該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果相似[10]。

2.3.2 溫度對菌株生長和降解性能的影響

微生物對環(huán)境溫度具有選擇性，不同的溫度條件通過調(diào)控微生物的產(chǎn)酶能力而間接影響到菌株的生長代謝及降解效能[11]。

實驗結(jié)果(圖5)表明，OTC-1有其最適生長的溫度區(qū)間，不同的溫度條件對其降解性能影響較大。在溫度由20℃逐漸上升至37℃的過程中，菌株生長量以及菌株對土霉素的降解率都呈現(xiàn)出幅度較大的上升趨勢，OD600值由20℃時的0.220上升達(dá)到最大值0.600，降解率由20℃時的16.66%增大至75.91%。在37～50℃梯度內(nèi)，菌株生長量出現(xiàn)顯著降低，這表明OTC-1是一種嗜中溫細(xì)菌，能在溫度適宜的條件下進行各項代謝活動，但超出其適宜溫度時活性迅速降低。而降解率在37～50℃梯度內(nèi)總體呈現(xiàn)下降趨勢，在45～50℃時有些微上升，其原因可能是高溫對四環(huán)素類抗生素的分解和水解具有促進作用[12]。

2.3.3 pH值對菌株生長和降解性能的影響

圖6所示為初始pH值由4.0逐漸上升至9.0過程中菌株生長量以及菌株對土霉素降解率的變化。由圖可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH值梯度在4.0～7.0時，菌株生長量及菌株對土霉素的降解率均隨著pH的增加而上升，分別上升了0.270和64.68%，并在pH值為7.0時達(dá)到最大值0.501和78.01%。但菌株生長量與降解率的上升幅度并不一致，在pH值梯度為5.0～6.0時，OD600上升幅度明顯不如降解率，這表明在酸性條件下pH值的小幅上升對菌株生長并無重大影響，卻能較大限度地促進菌株降解土霉素。其原因可能是菌株的代謝產(chǎn)物偏堿性，在酸性條件下與氫離子結(jié)合，減輕了代謝產(chǎn)物對菌株的毒性[13]。而當(dāng)pH值超過7.0繼續(xù)上升時，菌株生長量和降解率均出現(xiàn)幅度一致的較大下降趨勢。由此表明，過酸或過堿的條件對該菌株生長不利，在中性條件下，OTC-1可實現(xiàn)對土霉素的高效降解。

2.3.4 接種量對菌株生長量和降解率的影響

接種量的增加往往可以促進菌株種內(nèi)協(xié)同作用，幫助其迅速適應(yīng)環(huán)境，進而提高菌株的降解效率[10]。由圖7可知，在接種量由1%上升至20%的過程中，菌株生長量與菌株對土霉素的降解率均呈現(xiàn)出先上升后小幅度下降的趨勢，但菌株生長量與降解率的大幅上升區(qū)間并不完全一致。如圖所示，在接種量由1%上升至10%的過程中，菌株生長量在1%～5%梯度上升幅度較小，而在5%～10%梯度內(nèi)OD600迅速由0.200上升至最大值0.550，在10%～20%梯度呈現(xiàn)異常小幅下降。接種量的增加反而導(dǎo)致OD600值的下降，這表明當(dāng)接種量達(dá)到10%后培養(yǎng)基內(nèi)生物容納量已經(jīng)到達(dá)最大值。菌株對土霉素的降解率在1%～10%梯度內(nèi)持續(xù)上升，但大幅度上升出現(xiàn)在3%～5%梯度，5%～10%梯度上升幅度遠(yuǎn)小于3%～5%梯度。這表明隨著接種量的不斷增加，接種量對菌株降解土霉素效率的影響逐漸減小，但在10%梯度以內(nèi)仍存在積極影響。最終在接種量為10%時出現(xiàn)降解率最大值74.67%，接種量超過10%后降解率稍有下降。接種量取決于抗生素的種類、性質(zhì)和菌的種類。利用能力強的菌自然接種量少，反之，利用能力弱的所需接種量就多。與現(xiàn)有篩菌研究對比，菌株OTC-1對土霉素的利用能力較弱[7]。

2.3.5 轉(zhuǎn)速對菌株生長量和降解率的影響

轉(zhuǎn)速的大小可表示溶解氧的多少，含氧量對菌株的生命活動起著至關(guān)重要的作用。圖8所示為不同轉(zhuǎn)速對菌株生長量和菌株對土霉素的降解率的變化。由圖可知，在轉(zhuǎn)速由0r/min增加至200r/min的過程中，菌株生長量和降解率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但上升和下降幅度并不相同。

轉(zhuǎn)速由0r/min逐漸增加至140r/min的過程中，菌株生長量在0～100r/min梯度時上升幅度較小，僅上升了0.080，而在100～140r/min梯度時大幅上升，最終在140r/min時OD600達(dá)到最大值0.510。這表明OTC-1為需氧細(xì)菌，活性隨著含氧量的增加而增強，隨著轉(zhuǎn)速逐步增加，高轉(zhuǎn)速時的菌株生長量與降解率對比低轉(zhuǎn)速時顯著提升。140～ 200r/min梯度時菌株生長量下降0.060。其原因可能是轉(zhuǎn)速過高使得剪切力加大，影響酶的活性，間接導(dǎo)致微生物的降解能力的下降。菌株對土霉素的降解率在0～100r/min梯度時上升幅度較大，增加了44.20%，而在100～140r/min呈現(xiàn)小幅上升，并在轉(zhuǎn)速為140r/min時達(dá)到最大值76.73%。轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min時，OD600值略有下降，但并未導(dǎo)致降解率的大幅下降，其原因可能是四環(huán)素類抗生素具有易被氧化的特性，溶解氧的增加可以在一定程度上促進土霉素的降解[14]。

3 討論

污染物的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)是當(dāng)今世界范圍內(nèi)廣受關(guān)注的環(huán)境問題之一，抗生素殘留所引發(fā)的生態(tài)安全問題具有持久性和隱蔽性。抗生素的問世直接促進了養(yǎng)殖業(yè)的迅速崛起，同時，由于對抗生素類藥物的使用和管制不當(dāng)，大量抗生素流入土壤和水體環(huán)境中。高濃度的抗生素不僅具有嚴(yán)重的生態(tài)毒性，同時導(dǎo)致大量耐性菌的產(chǎn)生[15]。由于養(yǎng)殖場的畜禽廢棄物中土霉素濃度較高，不耐土霉素的細(xì)菌無法存活，故較易篩選出能有效降解土霉素的菌株。本實驗篩選出一株土霉素高效降解菌，將其命名為OTC-1。

經(jīng)初步鑒定，OTC-1為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)?？死撞暇且环N兼性厭氧的革蘭氏陰性菌，當(dāng)前在農(nóng)業(yè)及環(huán)境污染物治理方面都有許多研究。有學(xué)者在2018年發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌具有降解四環(huán)素的能力，降解率可高達(dá)94.26%[16]；另有研究發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌在低氧環(huán)境下對菲具有降解能力[17]。本研究結(jié)果表明克雷伯氏菌在降解土霉素的過程中受溫度和pH值影響較大，在最適溫度(37℃)與中性pH值(7.0)條件下，菌株繁殖能力較強，對土霉素的降解性能最佳。Ngugen等人發(fā)現(xiàn)土霉素降解產(chǎn)物易損害生物的肝臟和腎臟，最終造成肝細(xì)胞的壞死，表明土霉素降解產(chǎn)物毒性可能較土霉素本身更嚴(yán)重，這與實驗過程中菌株在生長曲線后期大量死亡的現(xiàn)象相呼應(yīng)[18]。因此，進一步豐富土霉素降解菌的種庫資源，積極探索無害降解土霉素和闡明土霉素的降解途徑至關(guān)重要。

目前未有學(xué)者嘗試?yán)每死撞暇到馔撩顾?，本研究發(fā)現(xiàn)克雷伯氏菌對土霉素具有高效降解能力，豐富了土霉素降解菌的種類和數(shù)量。實驗結(jié)果證明，菌株OTC-1在土霉素濃度150mg/L、溫度37℃、pH值7.0、接種量10%和轉(zhuǎn)速140r/min條件下，于無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d后，對鹽酸土霉素的降解率可達(dá)到76.73%。