鄒 永,范振鑫,魏日鳳,林 珊,李東東,劉 偉,,*

(1.福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350002;2.福建農(nóng)林大學園藝學院,福建福州 350002;3.寧德師范學院生命科學學院,福建寧德 352000)

胃潰瘍是一種普遍存在的疾病[1],近年乙醇導致的胃潰瘍的發(fā)生率和患病率呈上升趨勢[2]。研究表明[3-4],胃損傷、潰瘍和胃腸道出血通常與過度飲酒有關(guān)。胃潰瘍的發(fā)病機制是多樣的,包括粘膜炎癥、氧化應激和上皮細胞凋亡[5-6]。目前,對無水乙醇導致的胃黏膜損傷,防治方式主要是通過化學藥物的治療[7],但是大多數(shù)藥物會對人體造成不良反應,因此,亟需一種高效無害的天然成分來代替這些藥物。相關(guān)研究表明,植物提取物對無水乙醇致胃黏膜損傷具有較好作用,主要是通過抗氧化、抗炎和提高胃黏膜保護因子有關(guān)來實現(xiàn),如Batran等[8]研究表明,長蒴黃麻葉乙醇提取物能提高SOD酶活,粘性蛋白含量,降低MDA含量,減輕胃部腺體損傷癥狀。因此,植物提取物作為保護乙醇致胃黏膜損傷的天然產(chǎn)品具有良好的市場前景。

柳葉蠟梅是畬族的重要藥材之一,黃酮類物質(zhì)和萜類是柳葉蠟梅中的主要活性成分[9],其醇提物經(jīng)不同極性溶劑萃取可得到活性物質(zhì)不同的極性組分。根據(jù)“相似相溶”的原理,植物中的活性成分與溶劑體系的相似性有關(guān),黃酮類物質(zhì)富集于極性大的組分[10-11],如乙酸乙酯組分[12]。脂肪酸酯類和萜類化合物主要富集于石油醚組分[13-15]。黃進波等[16]研究表明,竹葉黃酮能拮抗乙醇誘導的胃黏膜損傷,其機制可能與其抗氧化、抑制氧自由基產(chǎn)生并升高胃黏膜NO、PGE2含量有關(guān)。賀海波等[17]研究表明,木瓜三萜(50、100 mg/kg)通過增加胃液分泌量、胃液酸度、胃黏膜血流量、胃結(jié)合黏液量,對吲哚美辛致小鼠胃黏膜損傷具有較好的保護作用。由此推測,柳葉蠟梅中的黃酮和萜類可能對胃黏膜損傷也具有一定的保護作用。柳葉蠟梅對消化作用具有一定積極作用,但目前相關(guān)功能及機理還處于初級階段,柳葉蠟梅對乙醇造成的極性胃黏膜損傷的保護作用及相關(guān)機理更是一片空白。作為一種新型藥食兩用的原料,結(jié)合其活性成分的研究,探索其作用功效和機理具有重要意義。

因此,本研究通過建立大鼠急性無水乙醇性胃黏膜損傷模型,研究柳葉蠟梅醇提物中乙酸乙酯萃取組分(Ethyl acetate fraction,EF)和石油醚萃取組分(Petroleum ether fraction,PF)組分對胃黏膜抗氧化和抗炎水平,同時結(jié)合胃黏膜潰瘍面積、病理蘇木精伊紅(Hematoxylin-eosin Staining,HE)和阿利新藍-過碘酸-雪夫(Alcian Blue-Periodic Acid Schiff,AB-PAS)粘液蛋白染色評價胃黏膜組織病理學變化,來評價其保護胃黏膜作用機制,并為新型藥食同源材料畬藥柳葉蠟梅功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

柳葉蠟梅(ChimonanthusSalicifolius) 寧德壽寧縣福瑞泰生物技術(shù)有限責任公司;Wistar大鼠(雄性,SPF級,77只150～180 g,6周齡) 上海斯萊克實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(滬)2017-0005;瑞巴派特片 浙江大冢制藥有限公司;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;羧甲基纖維素鈉、戊巴比妥鈉、4%多聚甲醛 福州佰泉生物技術(shù)有限公司;前列腺素E2(PGE2)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)檢測試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

DHG-9070A多功能酶標儀 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Sigma 3-16kL型高速冷凍離心機 南京貝登醫(yī)療股份有限公司;XHF-型內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司;島津UV-2700型多功能紫外可見分光光度計 島津(香港)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柳葉蠟梅醇提物極性組分的制取 參照文獻[18]中方法,并對其進行改進,柳葉蠟梅鮮葉在140 ℃滅酶10 min,80 ℃烘干30 min后粉碎,每千克柳葉蠟梅以7 L的85%乙醇滲漉提取,滲漉液流量為4 mL·kg-1·min。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),冷凍干燥得粗提粉末。每份取90 g粉末加入400 mL水加熱至65 ℃攪拌溶解,依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯萃取[19],各萃取部位氮氣吹干或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后密封包裝分別為PF和EF于硅膠干燥器中保存。

1.2.2 動物模型的建立 參考文獻[20-22]中方法,將77只大鼠分籠飼養(yǎng),經(jīng)5 d適應性喂養(yǎng)后禁食24 h,按體重隨機分為空白對照組(灌服等體積0.5%羧甲基纖維素鈉)、模型組(灌服等體積0.5%羧甲基纖維素鈉)、陽性瑞巴派特組(50 mg·kg-1·bw)、EF高、中、次低、低劑量組(400、200、100、50 mg·kg-1·bw)、PF高、中、次低、低劑量組(400、200、100、50 mg·kg-1·bw),每組7只,各組依照10 mL·kg-1·bw的灌胃體積灌服14 d。末次灌胃后禁食不禁水24 h,各組于次日建模前1 h再次灌胃受試物。除空白組灌胃等體積生理鹽水外,各組均灌服5 mg·kg-1·bw劑量的無水乙醇來建造急性胃黏膜損傷模型。

1.2.3 組織樣品采集 灌胃無水乙醇1 h后處死所有大鼠,收集其胃組織,沿胃大彎剪開胃體,用冰生理鹽水洗凈后用濾紙吸干鋪開在白底板上拍照記錄,選取損傷最嚴重的部位以手術(shù)刀切成5 mm×10 mm大小組織塊,浸泡在含9 mL 4%多聚甲醛的10 mL離心管中,24 h內(nèi)對胃組織進行HE染色切片和AB-PAS染色切片。其余胃組織切割成均勻小塊分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管,以干冰暫存,后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱儲存。

1.2.4 胃黏膜潰瘍抑制率 以直尺為參照物,將處理好的胃部組織平鋪白色背景板下,將SONY NEX5-R單反相機置于距樣品30 cm的高度,在相同拍攝采集胃組織圖像,觀察色澤、光滑度和水腫、淤血的情況。應用Image-pro plus圖像處理軟件對黏膜圖片中出血、紅腫區(qū)域進行面積記分[23],按以下公式計算潰瘍抑制率:

式中:I表示潰瘍抑制率,%;A表示模型組平均損傷面積,像素(pixel);Ai表示各組(EF、PF、陽性瑞巴派特組)平均損傷面積,像素(pixel)。

1.2.5 HE染色病理評估 將各組損傷最嚴重的胃黏膜修剪成5 mm×10 mm的組織塊,放入體積分數(shù)4%的多聚甲醛溶液固定,用流水沖洗洗去固定液,將組織移入體積分數(shù)70%的乙醇溶液中保存。將組織依次置于70%、85%、90%及100%的乙醇中梯度脫水至組織塊完全脫水透明,并經(jīng)包埋、切片(6 μm)、HE染色于100倍的微鏡下采集胃黏膜組織的細胞病理圖像[24]。

1.2.6 胃黏膜糖蛋白研究 按照1.2.5的制片方式處理,在胃黏膜組織石蠟切片的步驟后,采用AB-PAS染色,于100倍的顯微鏡下隨機選擇3組胃黏膜上皮區(qū)域采集圖像,利用圖像處理軟件image pro-plus對粘液面積進行積分,結(jié)果以像素值表示[25]。

1.2.7 檢測指標及方法 在檢測大鼠胃組織生理指標前,需要將組織勻漿化[26-27]。按照試劑盒操作測定大鼠胃組織勻漿中SOD、CAT、MDA、PGE2和NO等生化指標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差(Mean±SD)表示,用SPSS 23.0(美國IBM公司)進行處理,兩組均數(shù)比較采用獨立樣本T檢驗或非參數(shù)檢驗,不同樣品濃度與模型組或陽性瑞巴派特組比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃黏膜損傷抑制率

如表1所示,不同濃度的EF和PF對大鼠潰瘍均有一定的抑制作用。模型組胃黏膜表明出血和水腫狀態(tài)明顯。與模型組相比,EF和PF高劑量組胃黏膜表面瘍形態(tài)由細長條帶狀逐漸演變?yōu)椴贿B續(xù)的點狀,乙醇引起的出血和水腫程度有所減輕(圖1)。從潰瘍抑制率(表1)來看,EF和PF高劑量組均好于陽性瑞巴派特組,其中,EF高劑量組潰瘍抑制率最佳達到了92.51%,效果顯著優(yōu)于陽性瑞把派特組(P<0.05),高濃度劑量組效果要顯著好于次低劑量組(P<0.05)和低劑量組(P<0.01),而且EF高劑量組抑制率高于PF抑制率。由此說明灌胃柳葉蠟梅EF和PF高劑量組分會對大鼠胃黏膜損傷起到一定的保護作用,而且黃酮富集的EF組分效果要好于萜類物質(zhì)富集的PF組分[13-15]。

圖1 各組大鼠胃黏膜潰瘍情況Fig.1 Gastric mucosa ulcers in rats of each group

表1 各組中大鼠胃黏膜潰瘍抑制率(Mean±SD,n=7)Tab.1 Inhibition rate of rat stomach ulcer in each group(Mean±SD,n=7)

研究表明[28],灌胃無水乙醇會直接導致大鼠胃黏膜血液循環(huán)障礙、細胞壞死脫落、出血水腫等狀況。研究表明[8],長蒴黃麻葉萃取物能提高乙醇致胃黏膜損傷的潰瘍的抑制率,對無水乙醇造成的胃黏膜潰瘍有明顯的抑制作用。研究表明[29],葉黃素能夠降低乙醇致小鼠胃黏膜的潰瘍指數(shù),說明葉黃素對無水乙醇造成的胃部損傷有一定的保護作用。其結(jié)果與本試驗類似,柳葉蠟梅醇提物的兩種極性組分能抵御乙醇造成的胃部組織表觀血紅腫現(xiàn)象,并提高潰瘍抑制率,說明EF和PF組分增強了胃黏膜對無水乙醇的保護作用。

2.2 HE染色病理切片評估

如圖2所示,空白對照組小鼠的胃黏膜幾乎不存在破損斷裂的現(xiàn)象且腺體排列整齊。而模型組大鼠的上皮細胞壞死,胃黏膜出現(xiàn)斷裂和脫落,腺體排列紊亂,血管堵塞,固有層中腺體大量溶解。與模型組相比,兩種極性組分濃度越高,胃黏膜受到無水乙醇的損傷程度越輕,其中EF和PF高劑量組對胃黏膜的保護效果類似,表現(xiàn)為上皮細胞完整,腺體排列整齊,胃小凹清晰可見,固有層中腺體的完整性高,未見表層微血管充血,與陽性瑞巴派特組能達到相似的效果。EF和PF低劑量組分形態(tài)上接近模型組,保護效果較差。乙醇可導致嚴重的胃粘膜損傷,常用于誘導大鼠胃潰瘍[8]。周先容等[30]用60%的乙醇灌胃小鼠,觀察其病理學情況發(fā)現(xiàn),胃黏膜發(fā)生嚴重斷裂脫落,腺體排列紊亂。連續(xù)14 d灌胃普洱茶的小鼠胃黏膜受到酒精造成的損傷明顯低于空白對照組。灌胃普洱茶多酚后潰瘍現(xiàn)象得到明顯抑制。Sindhu等[29]用胡蘿卜素灌胃急性酒精致胃潰瘍的小鼠也得到了相似結(jié)果。由此可見,灌胃14 d柳葉蠟梅PF與EF高劑量組的大鼠胃黏膜對無水乙醇的損傷有一定的保護作用,主要表現(xiàn)為胃黏膜脫落、細胞出血壞死、炎性細胞浸潤等現(xiàn)象均得到較好抑制。

圖2 各組大鼠胃黏膜切片HE染色(HE,100×)Fig.2 HE staining of gastric mucosal slice in each group(HE,100×)

2.3 各組大鼠胃黏膜糖蛋白含量

胃黏膜中粘液的分泌量與粘液蛋白含量呈正相關(guān),其中以酸性粘液蛋白為主[31],通過AB-PAS染色法,將黏膜表面的酸性粘液蛋白染成藍色,結(jié)果如圖3所示,表2為胃黏膜中酸性粘液蛋白面積?？瞻捉M的胃黏膜酸性粘液蛋白分布于胃黏膜的柱狀上皮細胞,表現(xiàn)出完整連續(xù)的特征。模型組藍染色面積明顯降低且不連續(xù),說明酸性粘液蛋白被破壞,胃黏膜柱狀上皮細胞消失。與模型組相比,EF、PF高、中劑量組明顯提高了酸性粘液蛋白含量,形態(tài)上與空白組類似,EF、PF高、中劑量組與陽性瑞把派特組無顯著差異,說明其效果與陽性藥物類似。此外,PF高劑量組分酸性粘液蛋白面積高于EF高劑量組分,可以看出萜類富集的極性組分對酸性粘液蛋白含量的提升作用要好于黃酮類物質(zhì)富集的極性組分。

圖3 各組大鼠胃黏膜切片AB-PAS染色(100×)Fig.3 AB-PAS staining of gastric mucosa in each group(100×)

表2 各組大鼠胃黏膜中酸性粘液蛋白面積(Mean±SD,n=7)Table 2 Area of acid mucin in gastric mucosa of rats in each group(Mean±SD,n=7)

研究表明[32-33],胃黏膜屏障是最外層粘液產(chǎn)生一個穩(wěn)定靜止的層面,主要為酸性粘性蛋白,它既能中和胃酸又能杜絕腔內(nèi)胃蛋白產(chǎn)生的通透屏蔽作用,因此其完整性決定了胃黏膜抵御有害物質(zhì)的侵害。酸性粘液蛋白合成與血液流量提高有關(guān)[25]。因此,柳葉蠟梅醇提物的EF和PF組分可能是通過提高血流量來提高酸性粘性蛋白的分泌進而提升其抵御無水乙醇損傷的能力。

2.4 胃黏膜中PGE2、NO、SOD、CAT、MDA水平檢測

利用試劑盒測定胃黏膜的炎癥指標,結(jié)果如表3所示,與空白組相比,模型組的PGE2水平極顯著提高(P<0.01),NO的水平則無顯著差異。與模型組相比,陽性瑞巴派特組、EF和PF各劑量組PGE2含量均極顯著下降(P<0.01);EF高、中劑量組分可以顯著降低NO水平(P<0.05),PF各組分均對NO水平無顯著影響,說明低極性的活性物質(zhì)對胃黏膜中NO影響不顯著。與陽性瑞巴派特組相比,EF和PF高中劑量組PGE2水平并未有顯著差異,而EF和PF次低和低劑量組PGE2水平極顯著提高(P<0.01),說明中高劑量組的兩種組分與陽性藥物可以達到相似的效果。

表3 各組大鼠胃黏膜PGE2含量、NO含量、SOD活力、CAT活力、MDA含量(Mean±SD,n=7)Table 3 Effect of EF and on the level of PGE2,NO,SOD,CAT,MDA(Mean±SD,n=7)

PGE2和NO對胃黏膜具有一定的保護作用[23-34]。黃近波等[16]研究葉竹葉黃酮發(fā)現(xiàn),竹葉黃酮能夠提高胃黏膜NO、PGE2含量進而實現(xiàn)保護胃黏膜的作用。史李娜等[20]研究表明,石榴皮多酚有效部位對胃黏膜損傷有明顯修復作用,且明顯升高胃潰瘍大鼠胃黏膜NO含量、增加PGE2含量。但在本試驗中,各試驗組的PGE2水平極顯著低于模型組(P<0.01)。相較空白組,模型組、陽性瑞巴派特組、EF和PF高、中、次低、低劑量組中PGE2含量分別提高了123.13%、26.25%、17.87%、46.76%、95.50%、98.87%、30.40%、35.25%、73.76%、77.04%,由此看出各組PGE2水平均有所提高,結(jié)合HE染色切片結(jié)果發(fā)現(xiàn),損傷越嚴重的組分PGE2含量越高,原因可能是服用陽性藥物和高濃度組分的EF、PF能使機體產(chǎn)生內(nèi)源性PGE2,其含量的提高可以抵御無水乙醇的損傷。而模型組和低濃度EF、PF組PGE2含量明顯增加,可能是由于機體內(nèi)的PGE2含量不足以抵抗無水乙醇對胃黏膜的損傷,從而產(chǎn)生的應激作用引起。此外,EF、PF高、中劑量組均在不同程度上增加了酸性胃粘液蛋白含量,其中PF高劑量組分PGE2和酸性胃粘液蛋白含量高于EF組分。由此推測,EF和PF高劑量組分能促進PGE2適當分泌,增強胃黏膜屏障作用,增加黏膜表面酸性黏膜蛋白的分泌和血流量,以降低乙醇誘導的損傷,且富含萜類等極性較低的活性物質(zhì)的PF組分具有更好的效果。

小鼠胃黏膜中抗氧化水平如表3所示。相對空白組,模型組中SOD酶活力顯著下降(P<0.05),CAT變化不顯著。與模型組相比,陽性瑞巴派特組、EF、PF高劑量組均顯著提高了大鼠胃中SOD酶的活力(P<0.05)。除了中、低劑量的EF組分,其余試驗組CAT酶活與陽性藥物相當,說明過氧化氫清除能力較好。與空白組相比,模型組MDA變化不顯著,但陽性藥物能顯著降低胃黏膜中MDA含量(P<0.05)。EF高劑量組中MDA含量極顯著低于模型組(P<0.01),中低劑量EF組對MDA無顯著影響,說明高劑量EF組能夠抑制胃黏膜的脂質(zhì)過氧化。除了PF高劑量組,其余劑量的PF組MDA含量與模型組存在顯著差異,且與劑量呈正相關(guān)。高劑量PF組產(chǎn)生較高MDA含量的原因可能是PF極性小,根據(jù)“相似相溶”原理提取出的物質(zhì)中脂類總量較多[13-15],造模前在胃中殘留。

無水乙醇造成胃損傷與胃黏膜的氧化應激水平上升息息相關(guān)[35],SOD和CAT是機體內(nèi)重要的抗氧化防御體系[36]。MDA是評判脂質(zhì)過氧化的重要指標與細胞的損傷程度成正相關(guān)[37]。攝入過量無水乙醇時,機體的活性氧含量超過防御系統(tǒng)清除能力時,胃腸道就會受到損傷[38]。史李娜等[20]研究表明,石榴皮多酚有效部位對胃黏膜損傷有明顯修復作用,并能提高胃潰瘍大鼠胃黏膜SOD活性及降低MDA含量。沈玖君等[23]發(fā)現(xiàn)魔芋粉能夠提高SOD活力并降低MDA含量,進而降低了胃黏膜的損傷。本試驗中高劑量EF、PE組能提高SOD和CAT酶活力,EF組還能降低MDA的含量。上述試驗結(jié)果與本試驗類似,由此推測,EF和PF高劑量組分均可通過提高SOD和CAT活性,來提高了清除自由基和過氧化氫的能力,進而降低了胃黏膜的損傷。此外,EF高劑量組分中的黃酮類物質(zhì)還可能通過減少自由基與膜內(nèi)不飽和脂肪酸的結(jié)合,使MDA含量下降,達到抑制胃黏膜的脂質(zhì)過氧化目的,進而提高胃黏膜對無水乙醇的抵御能力。

3 結(jié)論

柳葉蠟梅醇提物的兩種極性成分對無水乙醇致大鼠急性胃黏膜損傷具有保護作用,柳葉蠟梅醇提物的EF、PF高劑量組均能夠提高胃黏膜潰瘍抑制率,防止胃黏膜脫落和細胞出血壞死,降低炎性細胞浸潤,來維持胃黏膜正常的生理結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,其中EF組分的效果要好于PF的組分。通過柳葉蠟梅醇提物EF和PF高劑量組分均能在促進酸性粘液蛋白的分泌,提高SOD、CAT酶活,降低胃黏膜應激產(chǎn)生的PGE2,EF高劑量組還能降低MDA和NO的含量,初步探究柳葉蠟梅醇提物的兩種極性物質(zhì)保護胃黏膜的機制可能是通過提高胃黏膜抗氧化和抗炎能力,促進內(nèi)源性PGE2分泌,加速胃黏膜組織的血液流量,進而促進酸性粘性蛋白的分泌,加固保護胃黏膜的屏障,從而降低一次性大量飲用無水乙醇對胃黏膜的損傷程度。以上結(jié)果說明柳葉蠟梅醇提物的EF和PF組分對無水乙醇致胃黏膜損傷具有較好的保護作用,為其功能性食品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。