肖興寧,楊 力,張建民,廖 明,李延斌,肖英平,楊 華,*,汪 雯,*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(杭州),農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室,浙江杭州 310021;2.中國計量大學(xué)信息工程學(xué)院,浙江杭州 310018;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642;4.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;5.阿肯色大學(xué)生物與農(nóng)業(yè)工程系,阿肯色州費耶特維爾 72701)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌,我國每年約有3億人因沙門氏菌感染而患病[1-2]。肉雞是沙門氏菌的常見宿主,易在屠宰加工過程(淋雞、掛雞、宰殺、瀝血、浸燙、脫毛、掏膛、內(nèi)腔淋洗、預(yù)冷清洗等環(huán)節(jié))發(fā)生交叉污染[3-4]。有研究表明,肉雞屠宰預(yù)冷后沙門氏菌污染率從10%～12.5%升高至27.5～37.5%[5-6]。因此,預(yù)測屠宰預(yù)冷清洗過程中沙門氏菌污染率的變化,對保障產(chǎn)品安全具有重要意義。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(artificial neural network,ANN)模型是一種模仿生物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分布式并行信息處理的數(shù)學(xué)模型[7-8]。與傳統(tǒng)的線性或非線性回歸方法相比,它具有以下優(yōu)點:較強的學(xué)習(xí)能力;是一個多輸入多輸出的系統(tǒng);是一種復(fù)雜的非線性系統(tǒng);可以并行運算,具有極快的運算速度,響應(yīng)時間短,可以滿足在線模擬、在線優(yōu)化的需要[9-11]。Singh等[12]比較了響應(yīng)面模型和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型用于蠟樣芽孢桿菌MTCC 1305產(chǎn)生L-谷氨酰胺酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測結(jié)果優(yōu)于響應(yīng)面模型。廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(General Regression Neural Network,GRNN)是建立在數(shù)理統(tǒng)計基礎(chǔ)上的徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò),其理論基礎(chǔ)是非線性回歸分析[13]。陳光等[14]構(gòu)建GRNN模型實現(xiàn)了對高爐煉鐵能耗的預(yù)測。反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Back Propagation Neural Networks,BP)算法簡單,易于實現(xiàn)。單金卉等[10]構(gòu)建了BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)用于實現(xiàn)油炸外裹糊魚塊的丙烯酰胺含量的預(yù)測。Cheng等[8]也構(gòu)建了BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型用于徑流量的預(yù)測。與反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型相比,廣義回歸網(wǎng)絡(luò)擁有更好的泛化能力,同時還具有網(wǎng)絡(luò)計算結(jié)果全局收斂的特性以及具有更強的非線性映射能力和學(xué)習(xí)速度[13]。此外,GRNN建模需要的樣本數(shù)量少,對于樣本數(shù)據(jù)缺乏的預(yù)測問題,采用GRNN模型能更好的滿足預(yù)測結(jié)果的精度要求[7]。

目前,雞肉沙門氏菌風(fēng)險評估中鮮見用ANN模型對預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)交叉污染沙門氏菌污染率的預(yù)測研究。課題組前期構(gòu)建了響應(yīng)面模型預(yù)測細(xì)菌污染率[15]。本研究建立以初始污染水平、初始污染率、NaClO濃度為輸入值,預(yù)冷后沙門氏菌污染率為輸出值的GRNN模型,預(yù)測雞胸肉預(yù)冷清洗后的沙門氏菌污染率,為優(yōu)化預(yù)冷清洗工藝和雞肉沙門氏菌定量風(fēng)險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腦心浸液肉湯(BHI)、緩沖蛋白胨水(BPW)、木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂(XLT4)培養(yǎng)基 均美國BD公司;亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC) 青島海博生物技術(shù)公司;NaClO溶液 生工生物工程(上海)股份有限公司;斯坦利沙門氏菌BYC12(S. Stanley)、印第安納沙門氏菌HZC10(S. Indiana)、鼠傷寒沙門氏菌YXC1(S. Typhimurium)、湯卜遜沙門氏菌LWC10(S. Thompson)、肯塔基沙門氏菌CBC2(S. Kentucky) 5株菌均分離于廣州某屠宰場,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供,菌株保存于含有20%甘油的腦心浸液肉湯中,儲存于-80 ℃冰箱備用;雞胸肉 浙江省杭州市華潤萬家超市。

Thermo Fisher 1389型生物安全柜 英國Waltham;HVA-85型高壓滅菌鍋 日本Hirayama;KB240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國Binder;Seward 400型拍打式均質(zhì)機 英國Seward公司;WASP 2型螺旋接種儀 英國Don Whitley Scientific公司;ProtoCOL3型全自動細(xì)胞計數(shù)儀 英國Synbiosi公司;CS180型百靈達(dá)余氯傳感儀 英國Palintes公司;CR400型手持式色差儀 日本ChromaMeter公司;Hitachi 7650型透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;TX150型水浴鍋 英國Grant公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備及雞肉接種 5株菌株解凍后分別接種至5 mL BHI液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),將菌液等體積均勻混合,制得25 mL菌種原液,約9lg CFU/mL。用BPW稀釋菌種原液,使初始接種液濃度約為7lg CFU/mL。將雞肉浸泡于接種液中30 min,轉(zhuǎn)移至無菌稱量盤,在生物安全柜內(nèi)靜置30 min,確保細(xì)菌附著在雞肉表面。雞肉表面初始接種水平約為5lg CFU/g。

1.2.2 預(yù)冷清洗實驗設(shè)計及預(yù)冷清洗 將響應(yīng)面試驗法(response surface methodology,RSM)與GRNN結(jié)合,既可以通過RSM的設(shè)計方法減少試驗次數(shù),又能利用GRNN更高的預(yù)測精度,減小預(yù)測誤差。選取初始污染水平、初始污染率和NaClO濃度作為影響污染率的關(guān)鍵因素,采用響應(yīng)曲面方法中的Central Composite design中心組合設(shè)計研究清洗過程中各因素的作用以及因素間的交互作用[16-18]。所有實驗因素均為5個水平(-α,-1,0,+1,+α),具體因素水平如表1所示。

表1 因素組合表Table 1 Levels of variables in the experiment

為了調(diào)查預(yù)冷清洗過程中的污染率變化,實驗前,將水浴鍋溫度調(diào)節(jié)至4 ℃,雞肉與清洗水的比例為1∶10 (w/v)。以表2第一組交叉污染清洗試驗條件為例,在水浴鍋中共放入30塊雞胸肉,對其中10塊雞肉進(jìn)行人工接種(1.8lg CFU/g),其余20塊為無菌雞肉,將接種雞肉與無菌雞肉全部放入濃度為79.7 mg/L NaClO的水中清洗40 min,實驗于室溫下進(jìn)行25 ℃,整個實驗重復(fù)2次。其余19組交叉污染清洗過程與第一組的操作一致。

1.2.3 污染率測定及計算 清洗后雞肉樣本轉(zhuǎn)移至含有25 mL BPW的均質(zhì)袋中,以250 r/min速度拍打1 min,取1 mL均質(zhì)液至9 mL SC增菌液中,37 ℃過夜培養(yǎng)。取10 μL增菌液涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h,若平板長出黑色菌落,則判斷為沙門氏菌陽性樣本。雞肉清洗后沙門氏菌污染率(P,%)計算如公式1所示,

式(1)

式中:T為雞肉清洗后沙門氏菌陽性樣本量,S為雞肉樣本總量。

1.2.4 GRNN模型的建立及模型評價 廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型由4層結(jié)構(gòu)組成:輸入層即為研究設(shè)定的自變量,模式層是對樣本進(jìn)行訓(xùn)練的隱回歸層,模式層數(shù)據(jù)由輸入層數(shù)據(jù)經(jīng)高斯傳遞函數(shù)傳遞得到,模式層神經(jīng)元個數(shù)與輸入層神經(jīng)元個數(shù)相等,模式層神經(jīng)元傳遞函數(shù)如公式2所示。求和層利用2種不同類型的神經(jīng)元對模式層神經(jīng)元數(shù)據(jù)求和,求和層求和方式分為直接求和(公式3)與加權(quán)求和(公式4)。最終運算得到結(jié)果傳至輸出層,輸出層將求和層結(jié)果相除得到估計結(jié)果(公式5)[14,19]。在本研究中,輸出層中有一個節(jié)點,即預(yù)冷后沙門氏菌污染率。輸入層中有三個節(jié)點,分別為初始污染水平、初始污染率、NaClO濃度,沙門氏菌污染率預(yù)測的廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 沙門氏菌污染率的廣義回歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型Fig.1 GRNN prediction model of Salmonella incidence

式(2)

式中:X為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入變量;Xi為第i個神經(jīng)元的學(xué)習(xí)樣本。

式(3)

式中:SD為直接求和輸出值。

式(4)

式中:SNj為加權(quán)求和輸出值。

式(5)

式中:yj為模型輸出層參數(shù)值。

相關(guān)系數(shù)r值是用于表明實際值和預(yù)測值之間的線性相關(guān)性。預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard error of prediction,SEP),如式(6)常用來評價網(wǎng)絡(luò)模型是否合適,SEP值越小意味著該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的性能越好[8,10,20-21]。平均絕對誤差(Mean absolute error,MAE)能更好的反映預(yù)測值誤差的實際情況[22-23],如式(7)。

式(6)

式(7)

GRNN模型的驗證數(shù)據(jù)集為選用雞胴體樣本進(jìn)行額外的8組預(yù)冷清洗實驗(測試集中未出現(xiàn)的數(shù)據(jù)集),得到的細(xì)菌污染率結(jié)果用于模型驗證。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗重復(fù)2次,取其平均值,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本研究采用JMP 10軟件進(jìn)行Central Composite design實驗設(shè)計,并利用NeuralTools7建立GRNN模型,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胸肉預(yù)冷清洗后的細(xì)菌污染率

雞胸肉預(yù)冷后沙門氏菌的污染率如表2所示,清洗后的細(xì)菌污染率變化范圍為30.0%～91.7%。初始污染水平、初始污染率和NaClO濃度對污染率均有顯著性影響(P<0.05),其中初始污染水平對污染率的影響最為顯著(表3)。初始污染水平和初始污染率與細(xì)菌污染率呈正相關(guān),NaClO濃度與細(xì)菌污染率呈負(fù)相關(guān)[15]。Yang等[5]研究發(fā)現(xiàn)添加50 mg/L的氯,可使細(xì)菌污染率下降到20%。因此預(yù)冷水中添加氯殺菌劑,可顯著降低屠宰加工過程中的沙門氏菌污染率[5,24]。然而,有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)菌對氯殺菌劑存在抗性時,未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染率和氯濃度之間的相關(guān)關(guān)系[25]。

表2 各因素組合下的污染率實際值及GRNN模型的污染率預(yù)測結(jié)果Table 2 Actual data and predict data by GRNN for post-chill incidence under different combination of factors

表3 各因素方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis in each factor

2.2 GRNN的訓(xùn)練結(jié)果

采用16組數(shù)據(jù)作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集,預(yù)冷清洗后的沙門氏菌污染率實際值與預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)為0.93(圖2),模型SEP值為10.8%,表明該GRNN模型擬合能力良好,可通過訓(xùn)練數(shù)據(jù)概括出各因素影響沙門氏菌污染率的內(nèi)在規(guī)律,較準(zhǔn)確模擬雞胸肉預(yù)冷清洗中沙門氏菌污染率的變化。基于3因素5水平的中心組合響應(yīng)面實驗設(shè)計被廣泛用于ANN建模中[22,26-28]。Ghosh等[22]基于該實驗設(shè)計的20組數(shù)據(jù),構(gòu)建Cu吸附的ANN模型,并選取其中的12組數(shù)據(jù)作為模型的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集。Sinha等[26]也基于3因素5水平的中心組合響應(yīng)面試驗設(shè)計下的20組數(shù)據(jù),構(gòu)建了微波輔助提取紅木種子中的天然染料的ANN預(yù)測模型。由此可見,基于RSM實驗設(shè)計獲取的數(shù)據(jù)量可用在ANN模型的構(gòu)建中并較好的實現(xiàn)預(yù)測。

圖2 GRNN模型訓(xùn)練集實際值與預(yù)測值的比較Fig.2 Compare the actual values and predicted values from the training set of GRNN model

2.3 RSM與GRNN模型擬合效果比較

課題組前期構(gòu)建了RSM模型預(yù)測雞胸肉預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)的沙門氏菌污染率[15],本研究利用訓(xùn)練好的GRNN模型對8組驗證數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果如表4所示。RSM模型和GRNN模型的r值均大于0.9、SEP值均小于35%并且MAE值均較小(表5),表明GRNN和RSM模型均可較好的預(yù)測雞胸肉預(yù)冷清洗后的沙門氏菌污染率,但ANN模型預(yù)測能力略優(yōu)于RSM模型。Yang等[23]構(gòu)建ANN和RSM模型優(yōu)化蕓豆抗氧化劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANN模型的預(yù)測精確度優(yōu)于RSM模型。在利用RSM和ANN模型預(yù)測羧化纖維素納米晶須修復(fù)水中銅的能力研究中也發(fā)現(xiàn)ANN模型的預(yù)測能力較好[27]。

表4 RSM模型與GRNN模型驗證結(jié)果Table 4 Validation for RSM and GRNN models

表5 RSM模型與GRNN模型評價結(jié)果Table 5 Model evaluation for RSM and GRNN models

3 討論與結(jié)論

RSM的設(shè)計方法可減少試驗次數(shù),RSM模型的原理是回歸技術(shù),在多項式類型中,多元三次方程與生物學(xué)結(jié)合的并不是很好(高次方程所繪曲線易出現(xiàn)波峰和波谷),因此普遍采用多元二次方程[28-29]。ANN被廣泛用于非線性多元建模,與RSM模型相比,ANN的主要優(yōu)勢在于它可較好擬合大多數(shù)非線性函數(shù)。Karnik等[28]構(gòu)建了ANN與RSM模型對鉆孔毛刺尺寸進(jìn)行預(yù)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ANN模型可更好的預(yù)測鉆孔毛刺尺寸。此外,當(dāng)數(shù)據(jù)量較少時,ANN也可較好的實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的擬合[30]。催化劑催化合成直鏈烷基苯的ANN模型構(gòu)建的數(shù)據(jù)來源于RSM實驗設(shè)計下的17組數(shù)據(jù)[31]。Desai等[30]認(rèn)為基于RSM的實驗數(shù)據(jù)足以建立有效的ANN模型。

本研究以初始污染水平、初始污染率、NaClO濃度為輸入層變量,雞胸肉預(yù)冷清洗環(huán)節(jié)的沙門氏菌污染率為輸出層變量構(gòu)建GRNN模型,其中網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集、測試數(shù)據(jù)集分別為16組、4組實驗數(shù)據(jù)。構(gòu)建的GRNN模型(r=0.93,SEP=13%)和課題組前期構(gòu)建的RSM模型(r=0.90,SEP=14%)均可較好的預(yù)測雞胸肉預(yù)冷清洗后的沙門氏菌污染率。RSM的設(shè)計方法可減少試驗次數(shù),ANN可提供更高的預(yù)測精度。因此,未來可考慮基于RSM實驗設(shè)計獲取的數(shù)據(jù)來構(gòu)建ANN模型用于預(yù)測。