蔡 冰，陳萬光，王 凡，左小玉

( 洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471934 )

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)為鮭科的冷水性代表魚類，因其肉質(zhì)鮮美而受到廣大消費(fèi)者的青睞，使其成為目前養(yǎng)殖最廣泛的淡水魚類之一[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度、飼料用量和水環(huán)境質(zhì)量等原因?qū)е潞琪V病害頻發(fā)?；【?Vibrio)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的致病菌，具有流傳廣和發(fā)病率高等特點(diǎn)，而弧菌病對虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展影響巨大[2]。

目前，對病原微生物的防控多使用抗生素和化學(xué)合成藥物，但這些藥物長期不合理的應(yīng)用會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致水產(chǎn)品中藥物殘留量超標(biāo)，造成環(huán)境的污染并最終威脅人類健康[3-4]。中草藥作為天然藥物，歷史悠久，富含各種活性物質(zhì)以及微量元素，具有毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢[5]。因此，中草藥在魚類養(yǎng)殖上的應(yīng)用不僅能夠預(yù)防治療疾病，還能夠保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。復(fù)方中草藥能夠有效結(jié)合各種不同的單一中草藥藥效，從而使預(yù)防和治療發(fā)揮到最大效果[6]。研究表明，復(fù)方中草藥添加劑能夠增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病力[4-5,7-11]。

紅棗、山藥和黃芪是我國常見食用兼藥用的中藥藥材。研究表明，大棗提取液對細(xì)胞及體液免疫均具有很強(qiáng)的促進(jìn)效果，可增強(qiáng)免疫功能[12]；山藥提取物能夠調(diào)控虹鱒免疫系統(tǒng)中的趨化因子信號途徑、白細(xì)胞經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞遷移通路和血小板活化通路[13]；黃芪提取物對鯉魚(Cyprinuscarpio)肝臟損傷具有一定的保護(hù)作用且對常見病原菌具有很強(qiáng)的抑菌效果[14-15]。

副溶血弧菌(V.parahemolyticus)容易引起細(xì)菌性食物中毒，主要分布于沿岸海水和水產(chǎn)品中，近年來，其在淡水魚體內(nèi)和養(yǎng)殖水體中被廣泛地檢測出[16]。筆者對投喂復(fù)方中草藥添加劑(紅棗提取物+山藥提取物+黃芪提取物)的虹鱒在副溶血弧菌感染下的抗氧化基因的表達(dá)影響進(jìn)行探索，以期解釋復(fù)方中草藥對虹鱒在病原菌刺激下的抗氧化免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，并為在虹鱒養(yǎng)殖中的復(fù)方中草藥添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

虹鱒幼魚購自四川省眉山市東坡區(qū)天貴水產(chǎn)養(yǎng)殖場，體長7.6～8.9 cm，于洛陽師范學(xué)院冷水魚養(yǎng)殖工程研究中心循環(huán)系統(tǒng)的圓柱形水族箱(直徑1 m)中暫養(yǎng)14 d；每日定時(shí)投喂虹鱒幼體基礎(chǔ)飼料2次；暫養(yǎng)期間，水溫11～15 ℃，pH 7.0±0.2，溶解氧>8.0 mg/L。取規(guī)格一致、游動(dòng)敏捷和健康良好的虹鱒幼體分組進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)試劑

紅棗提取物(20∶1型)、黃芪提取物(20∶1型)和山藥提取物(20∶1型)(陜西森弗天然制品有限公司)，副溶血弧菌(中國微生物菌種保藏中心)，總RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(東洋紡生物科技有限公司)，Gold View Ⅰ型核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)，2×Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，Bestar qPCR Mastermix(德國DBI公司)，基因引物(華大基因公司)。

1.3 試驗(yàn)飼料的制備

根據(jù)肉食性魚類的營養(yǎng)需求并參考相關(guān)虹鱒基礎(chǔ)飼料配方[17]，設(shè)計(jì)本試驗(yàn)虹鱒基礎(chǔ)飼料的配方：膨化豆粕35%、魚粉40%、糊化淀粉14.7%、魚油4%、大豆油4%、氯化膽堿0.3%、磷酸二氫鈣1%和預(yù)混料1%。先將20∶1的紅棗、黃芪和山藥提取物按照1∶1∶1比例配合成復(fù)合物，然后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%、0.6%和1.2%添加到基礎(chǔ)飼料中制成復(fù)合中草藥飼料，以復(fù)方中草藥零添加的基礎(chǔ)飼料為對照組?；A(chǔ)飼料及各添加劑組的飼料配方見表1。

表1 虹鱒飼料配方 %

1.4 試驗(yàn)飼料的投喂

試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對照組和3個(gè)添加組，其中對照組投喂基礎(chǔ)飼料組(即復(fù)合中草藥提取物添加量為0)，試驗(yàn)添加組分別投喂含復(fù)合中草藥提取物0.3%、0.6%和1.2%的基礎(chǔ)飼料。每組隨機(jī)挑選暫養(yǎng)后的虹鱒幼魚30尾進(jìn)行投喂試驗(yàn)，其他條件同暫養(yǎng)期間。

1.5 細(xì)菌攻毒試驗(yàn)與取樣

飼料投喂56 d后，隨機(jī)選取各組的虹鱒幼魚10尾，每尾注射0.2 mL副溶血弧菌(2.74×107cfu/mL)進(jìn)行攻毒試驗(yàn)；弧菌攻毒4 d后，對虹鱒幼魚進(jìn)行解剖，每組取出6尾虹鱒幼魚的中腸組織，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰箱中-80 ℃低溫保存，用于后期抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的檢測。

1.6 抗氧化相關(guān)基因表達(dá)的檢測

1.6.1 引物序列

內(nèi)參基因EF-1 Alpha以及目的基因GST、HSP90BB、CAT、GPx1和SOD基因的引物序列來源于參考文獻(xiàn)[18](表2)。

表2 PCR所用基因的特異性引物及其序列

1.6.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

按照總RNA極速抽提試劑盒提供的方法，提取每尾虹鱒幼體的中腸組織樣品，并對RNA進(jìn)行質(zhì)量分析。對質(zhì)量好、含量適宜和純度高的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.6.3 半定量PCR

半定量PCR是對各目的基因在對照組和添加劑組的虹鱒中腸的表達(dá)量是否存在差異的定性分析。為鑒定引物特異性是否符合半定量試驗(yàn)的要求，在進(jìn)行正式半定量反應(yīng)之前，用普通PCR來分析引物的特異性。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA加入特異性良好的目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、2×Tap MasterMix及無菌水制備成25 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。PCR擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察并保存各基因表達(dá)結(jié)果。

1.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為了驗(yàn)證半定量PCR的定性分析結(jié)果，并對各目的基因在對照組和添加劑組的虹鱒中腸中的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。為鑒定引物特異性是否符合實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)的要求，在進(jìn)行正式實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)之前，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀來分析引物的特異性。

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA加入特異性良好的目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、Bestar qPCR Mastermix及無菌水制備成20 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃ 86個(gè)循環(huán)。

1.6.5 數(shù)據(jù)分析

使用 SPSS 13.0軟件，對實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD方法比較復(fù)方中草藥添加劑組與對照組之間的差異顯著性(P<0.05差異顯著；P<0.01差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量和含量、內(nèi)參基因及目的基因特異性和有效性的檢測

提取的RNA 光密度(OD)值在1.8～2.0，通過凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)28S∶18S約為2∶1。RNA的質(zhì)量濃度為168.61～551.06 ng/μL。試驗(yàn)結(jié)果表明，RNA的質(zhì)量和質(zhì)量濃度整體符合反轉(zhuǎn)錄的要求。

瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果表明，目的基因和內(nèi)參基因引物電泳條帶單一明亮，且不拖尾(圖1)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對各基因的熔解曲線顯示，熔解峰單一(圖2)。試驗(yàn)結(jié)果表明，EF-1 Alpha、GST、HSP90BB、CAT、GPx1和SOD基因的引物特異性良好，符合半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)的要求。

圖1 虹鱒腸中內(nèi)參EF-1 Alpha及目的基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測

圖2 內(nèi)參EF-1 Alpha及目的基因的熔解曲線檢測

2.2 弧菌對添加中草藥飼料后的虹鱒腸道抗氧化相關(guān)基因表達(dá)定性分析

半定量PCR結(jié)果見圖3，通過分析添加各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的復(fù)方中草藥添加組的抗氧化基因(GST、HSP90BB、GPx1、CAT)和內(nèi)參基因(EF-1 Alpha)的表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GST與CAT基因的表達(dá)水平在0.3%和0.6%添加組有上調(diào)趨勢；HSP90BB基因的表達(dá)水平在0.3%和1.2%添加組有上調(diào)趨勢；GPx1基因的表達(dá)水平在0.3%添加組有上調(diào)趨勢；SOD基因的表達(dá)水平在0.3%、0.6%和1.2%添加組均出現(xiàn)明顯下調(diào)。

圖3 不同添加組虹鱒腸道抗氧化基因的定性表達(dá)情況

2.3 弧菌對添加中草藥飼料后抗氧化相關(guān)基因表達(dá)定量分析

與對照組相比，GST和CAT基因相對表達(dá)量在0.3%和0.6%添加組均出現(xiàn)顯著上升趨勢(圖4)，其中GST基因相對表達(dá)量分別上調(diào)30.5%和45.6%，CAT基因相對表達(dá)量分別上調(diào)302.10%和162.55%，而1.2%添加組與對照組相比差異不顯著；HSP90BB基因相對表達(dá)量在0.3%和1.2%添加組出現(xiàn)顯著上升趨勢，分別上調(diào)214.74%和60.75%，而0.6%添加組與對照組相比無顯著差異；GPx1基因相對表達(dá)量在0.3%添加組出現(xiàn)顯著上升趨勢，上調(diào)達(dá)107.55%，而0.6%和1.2%添加組與對照組相比差異不顯著；SOD基因相對表達(dá)量在0.3%和0.6%添加組卻出現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢，分別下調(diào)47.7%和59.6%，1.2%添加組與對照組相比差異不顯著。

圖4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加劑組虹鱒中腸基因mRNA的表達(dá)

3 討 論

動(dòng)物體內(nèi)抗氧化能力是機(jī)體非特異性免疫的重要組成部分，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[5]。抗氧化酶和熱應(yīng)激蛋白屬于重要的非特異性免疫指標(biāo)?；虮磉_(dá)水平一般是通過該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的多少來衡量的，編碼應(yīng)激相關(guān)蛋白和抗氧化酶基因的差異轉(zhuǎn)錄水平已被用于檢測外來物質(zhì)的生物學(xué)效應(yīng)[19-20]。腸道是魚類最大的免疫器官，中腸又稱主腸，因此，筆者對投喂復(fù)方中草藥添加劑(紅棗提取物+山藥提取物+黃芪提取物)的虹鱒在副溶血弧菌感染下的抗氧化基因mRNA影響進(jìn)行探索。

3.1 復(fù)方中草藥對虹鱒在副溶血弧菌感染下的抗氧化酶mRNA影響

活性氧是有機(jī)體內(nèi)最常見的自由基，而機(jī)體抗氧化系統(tǒng)作為一種完整而復(fù)雜的自由基清除系統(tǒng)，能夠保護(hù)自身免受氧化損傷[5,8]。SOD基因表達(dá)產(chǎn)物為超氧化物歧化酶，是機(jī)體清除自由基的重要抗氧化酶，能夠催化超氧化物陰離子自由基并且歧化為過氧化氫與氧氣，保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基氧化損傷[5,8,11]。CAT基因表達(dá)產(chǎn)物為過氧化氫酶，該酶是動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在的抗氧化酶，主要作用是將過氧化氫催化分解為水和氧氣，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒性產(chǎn)物[8]。谷胱甘肽系統(tǒng)是生物體內(nèi)的重要抗氧化系統(tǒng)，在機(jī)體非特異性免疫過程中發(fā)揮重要作用[21-22]。GPx基因表達(dá)產(chǎn)物為谷胱甘肽過氧化物酶，通過還原性谷胱甘肽催化還原過氧化物和有機(jī)過氧化物，從而保護(hù)細(xì)胞和其他如DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)體等敏感生物分子免受氧自由基損傷[5]。GPx1是GPx家族成員之一，能清除過氧化氫和脂肪酸過氧化氫[23]。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST基因表達(dá)產(chǎn)物)是生物體內(nèi)重要的解毒酶，可以清除細(xì)胞內(nèi)因宿主的免疫效應(yīng)而產(chǎn)生的自由基和過氧化物等產(chǎn)物[24]。

3.2 復(fù)方中草藥對虹鱒在副溶血弧菌感染下的熱應(yīng)激蛋白mRNA影響

HSPs基因表達(dá)產(chǎn)物是熱應(yīng)激蛋白，是一類在應(yīng)激狀態(tài)下幫助其他蛋白正確折疊的一類進(jìn)化上高度保守的蛋白家族[29-30]。其中HSP90BB是HSPs家族的重要成員之一，可通過抑制氧自由基的關(guān)鍵酶產(chǎn)生來減少氧自由基的產(chǎn)生，尤其是在免疫反應(yīng)時(shí)HSP90基因表達(dá)更為強(qiáng)烈[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，投喂添加復(fù)方中草藥飼料的虹鱒幼體在感染副溶血弧菌4 d后，0.3%和1.2%添加組HSP90基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，進(jìn)而可能致使HSP90蛋白水平提高。這表明，投喂0.3%和1.2%復(fù)方中草藥的虹鱒幼體可能通過提高HSP90蛋白水平來抑制自由基的關(guān)鍵酶產(chǎn)生，進(jìn)而減少氧自由基的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)虹鱒抗氧化能力。這與林天勢等[32]的研究病原菌感染大黃魚(Larimichthyscrocea)后熱應(yīng)激蛋白表達(dá)水平的結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

投喂復(fù)方中草藥飼料添加劑(紅棗+山藥+黃芪)后的虹鱒在受到副溶血弧菌感染時(shí)，CAT、GPx1、GST和HSP90BB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，從而可能致使抗氧化相關(guān)能力提高，其中0.3%添加組的效果較好。這一結(jié)果有助于復(fù)方中草藥添加劑的飼料在虹鱒水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中進(jìn)行推廣應(yīng)用。