廖偉 蔡崇明 陳金明

摘要：目的? 探究miR-200b靶向Hes1調(diào)控Notch信號通路對iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。方法? 采用結(jié)合維甲酸和無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)法誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化，分別在誘導(dǎo)分化的第0、4、8、15d采用實時熒光定量PCR檢測miR-200b水平，Westernblot法檢測Hes家族bHLH轉(zhuǎn)錄因子1（Hes1）、Notch1蛋白水平，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測并通過熒光素酶報告實驗驗證miR-200b與Hes1之間的靶向結(jié)合作用。結(jié)果? 在iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)分化的第0、4、8、15d，miR-200b水平逐漸升高，Hes1、Notch1蛋白水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;生物信息學(xué)分析顯示，Hes1為miR-200b的靶基因，過表達(dá)miR-200b可升高神經(jīng)干細(xì)胞分化，上調(diào)Hes1水平調(diào)控Notch信號通路相關(guān)分子。結(jié)論? miR-200b可促進iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化，其機制可能與其靶向上調(diào)Hes1表達(dá)，進而促進Notch信號通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞;神經(jīng)干細(xì)胞;miR-200b-Notch;信號通路

Abstract：Objective? To explore the effect of miR-200b targeting Hes1 to regulate the Notch signaling pathway on the differentiation of iPS cells into neural stem cells.Methods? Combining retinoic acid and serum-free medium was used to induce iPS cells to differentiate into neural stem cells. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the level of miR-200b on the 0th， 4th， 8th， and 15th d of the induced differentiation， and the Hes family was detected by Western blot method. The bHLH transcription factor 1 （Hes1） and Notch1 protein levels were predicted by bioinformatics software and the targeted binding effect between miR-200b and Hes1 was verified through the luciferase report experiment.Results? On the 0th， 4th， 8th， and 15th d after the differentiation of iPS cells into neural stem cells， the level of miR-200b gradually increased， and the levels of Hes1 and Notch1 protein gradually decreased，the difference was statistically significant （P<0.05）; Bioinformatics analysis showed that Hes1 is the target gene of miR-200b. Overexpression of miR-200b could increase the differentiation of neural stem cells and up-regulate Hes1 levels to regulate Notch signaling pathway related molecules.Conclusion? miR-200b could promote the differentiation of iPS cells into neural stem cells， and its mechanism might be related to its targeted up-regulation of Hes1 expression， which in turn promoted the activation of Notch signaling pathway.

Key words：Induced pluripotent stem cells;Neural stem cells;miR-200b-Notch;Signaling pathway

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS）是一類與胚胎干細(xì)胞（ES）具有相似全能分化特性的重編程多能干細(xì)胞，目前已有研究證實[1]，iPS可定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞等，而且通過iPS細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在其相應(yīng)疾病治療中可獲得較為理想的效果，但是關(guān)于iPS誘導(dǎo)分化的具體調(diào)節(jié)機制目前尚未完全確切。近年，越來越多研究發(fā)現(xiàn)[2，3]miR-200b和Notch信號在胚胎干細(xì)胞的增殖與分化發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，然而miR-200b和Notch信號是否能夠調(diào)控iPS細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的機制并不清楚。為此，本研究擬通過重組慢病毒技術(shù)、qRT-PCR等技術(shù)觀察iPS細(xì)胞定分化為神經(jīng)干細(xì)胞過程中mir-200b、Notch通路等相關(guān)信號分子的表達(dá)變化及作用，旨在闡明iPS細(xì)胞神經(jīng)定向分化的具體調(diào)控途徑，報道如下。

1材料與方法

1.1實驗材料? iPS-S細(xì)胞系（上海亞遊生物科技有限公司），TRIzon總RNA提取試劑（上海聯(lián)邁生物），F(xiàn)ast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒（上海一基生物），Ultra SYBR Mixture試劑盒（上海研謹(jǐn)生物），兔抗人 Notch1 單克隆抗體、兔抗人Hes1多克隆抗體（博士德生物公司）。

1.2方法

1.2.1誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化? 把iPS細(xì)胞接種在含有絲裂霉素C的鼠胚胎成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)層，集落長滿后加入膠原酶消化，先在無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)4 d，隨后置于含有維甲酸的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d，再在神經(jīng)干培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)7 d，最后接種到經(jīng)層粘連蛋白包被的24孔板中培養(yǎng)，分別收集誘導(dǎo)分化的第0、4、8、15天的細(xì)胞備用。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測? ①總RNA提取：取適量細(xì)胞樣本，加入1 mlTRIzon液的比例加入適量TRIzon液混勻，按照試劑盒說明書進行總RNA提取。②cDNA合成：應(yīng)用RT-PCR法進行檢測，取5 μl RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，以U6 RNA為內(nèi)參基因，嚴(yán)格按照Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒進行操作，加入miRNA莖環(huán)引物充分震蕩混勻，并予以短暫離心處理以使溶液集中于EP管底。然后將其置于42 ℃環(huán)境中孵育30 min，置于85 ℃中孵育3 min。最后對其進行短暫離心處理，并放在冰上冷卻獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。③實時定量PCR反應(yīng)：嚴(yán)格按照Ultra SYBR Mixture試劑盒說明書進行熒光實時定量PCR實驗，設(shè)置反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，進行擴增反應(yīng)，計算miR-200b表達(dá)量。

1.2.3 Westernblot檢測? 用RIPA裂解誘導(dǎo)分化的第0、4、8、15天樣本細(xì)胞提取的總蛋白，先采用紫外分光光度計檢測蛋白的濃度，利用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，進行封閉處理，添加兔抗人 Notch1 單克隆抗體、兔抗人Hes1多克隆抗體，4 ℃孵育后進行3次TBST洗膜，添加二抗在室溫下孵育1 h，隨后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，曝光后掃描膠片，使用Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以β-actin蛋白作為內(nèi)參，計算出目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，即為Hes1、Notch1蛋白相對表達(dá)量。

1.2.4熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測? 應(yīng)用TargetScan miRNA靶基因預(yù)測miR-200b在Hes1上的結(jié)合位點，構(gòu)建Hes1的3-非編碼區(qū)、Notch1的3-非編碼區(qū)報告基因質(zhì)粒，以此轉(zhuǎn)染至miR-200b穩(wěn)定表達(dá)，根據(jù)Dual-Luciferase（Promega）雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書檢測熒光素酶相對活性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法? 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)SPSS23.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用（%）表示，行？字2檢驗;計量資料以（x±s）表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

在iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)分化的第0、4、8、15天，miR-200b水平逐漸升高，Hes1蛋白、Notch1水平逐漸降低，不同時間點其表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1。生物信息學(xué)分析顯示，Hes1為miR-200b的靶基因，過表達(dá)miR-200b可升高神經(jīng)干細(xì)胞分化，上調(diào)Hes1水平調(diào)控Notch信號通路相關(guān)分子，見圖2、圖3。

3討論

作為一種神經(jīng)前體細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新并分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等大腦各類細(xì)胞的功能。從理論上來講，神經(jīng)干細(xì)胞有多向分化的潛能，因誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）可分化為多種能夠用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疑難疾病的細(xì)胞替代治療，具有廣大應(yīng)用前景[4]。然而，在實際臨床應(yīng)用中，神經(jīng)干細(xì)胞的替代治療仍處于非常早期基礎(chǔ)研究階段，而且受免疫排斥、倫理等問題影響，尚不能將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)為任意細(xì)胞，通常是誘導(dǎo)后的細(xì)胞中包含多種細(xì)胞類型。因此，探究iPS細(xì)胞誘導(dǎo)分化的調(diào)控機制對于其臨床應(yīng)用有重要意義。

miRNA是由21～25個小分子核苷酸所組成的非編碼RNA，廣泛分布在哺乳動物基因組，其能夠通過靶向作用于蛋白編碼基因，阻止蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄與翻譯，進而參與細(xì)胞發(fā)育、分化增殖、凋亡等多項生理過程[5]。多項研究顯示[6]，多種miRNA可調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子表達(dá)水平，在干細(xì)胞的調(diào)控、自我更新功能發(fā)揮著重要的作用。miR-200b為一種新型miRNA，有研究報道[7]，miR-200b在腦腫瘤組織中的表達(dá)水平較正常腦組織顯著升高。筆者在前期課題研究中發(fā)現(xiàn)在iPS細(xì)胞向NSC定向分化的過程中，miR-200b表達(dá)量明顯升高，我們推測miR-200b可通過其靶基因Notch1介導(dǎo)Notch信號通路調(diào)控了iPS細(xì)向NSC的定向分化過程。蔣明等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化神經(jīng)干細(xì)胞過程中miR-200b有可能是Notch信號通路的重要調(diào)控因子。

bHLH基因?qū)τ谏窠?jīng)干細(xì)胞的增殖、分化、自我更新能力有重要的作用。Hes家族中的7個成員均為bHLH基因，其中Hes1、Hes5為Notch基因的靶基因，其表達(dá)水平極易受Notch因子的增殖活化而上調(diào)。動物實驗研究證實[9]，Notch通路在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化調(diào)控中起著重要作用，也是維持神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵。房裕鈔等[10]的研究提出，在腦缺血再灌注損傷機制中miR-200b可通過Notch信號通路下調(diào)Hes1表達(dá)。秦杰等[11]研究報道Notch1和Hesl激活在調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞中的作用，當(dāng)敲除Hes1、Notch1基因時，不成熟神經(jīng)元分化數(shù)量會顯著增加，致使大范圍神經(jīng)發(fā)育缺陷，提示在神經(jīng)正常發(fā)育過程中，Hes1、Notch1對維持神經(jīng)干細(xì)胞的特性是必需的。本研究結(jié)果顯示，在iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)分化的第0、4、8、15天，miR-200b水平逐漸升高，Hes1、Notch1蛋白水平逐漸降低，且經(jīng)生物信息學(xué)分析證實Hes1為miR-200b的靶基因，可知miR-200b在體外促進神經(jīng)干細(xì)胞分化是通過抑制Notch信號通路來實現(xiàn)的。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)[12]，Notch信號通路在神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。在神經(jīng)發(fā)育過程中，表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Notch配體、受體均與神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖、維持及分化等過程密切相關(guān)[13]。有研究指出[14]，激活Notch信號通路有利于促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖，而抑制Notch信號通路可對神經(jīng)干細(xì)胞分化發(fā)揮促進作用。正鑒于此，筆者推敲Notch通路有可能參與miR-200b對神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)分化的調(diào)節(jié)過程，miR-200b過表達(dá)可使神經(jīng)干細(xì)胞Notch信號通路下游靶基因Hes1表達(dá)水平下降，進而抑制Notch信號通路，促進神經(jīng)干細(xì)胞分化。

綜上所述，miR-200b可促進iPS細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化，其機制可能與其靶向上調(diào)Hes1表達(dá)，進而促進Notch信號通路的激活有關(guān)。

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收稿日期：2020-05-09;修回日期：2020-06-12

編輯/成森