鄧波波，馮寶寶，詹康，霍永久，趙國琦

(揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇 揚州 225009)

瘤胃是反芻動物消化系統(tǒng)最重要結(jié)構(gòu)之一，動物食入的植物性飼料在瘤胃內(nèi)發(fā)酵成短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)來調(diào)節(jié)瘤胃的多種生理功能.瘤胃生理功能的正常運行離不開健全的屏障保護作用，瘤胃保護屏障由微生物屏障、物理屏障和免疫屏障組成.微生物屏障是依據(jù)瘤胃中微生物間共生、拮抗、競爭等方式來維持菌群平衡，抑制有害菌毒素的過度分泌；物理屏障是通過上皮細胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)，阻止毒素和病原體從瘤胃上皮進入血液；免疫屏障是由腸相關(guān)的免疫細胞及分泌的細胞免疫因子組成[1].到目前為止，從瘤胃微生態(tài)環(huán)境因素到宿主本身的生理條件，已經(jīng)有很多因素被報道與這些屏障功能有關(guān).其中短鏈脂肪酸最受關(guān)注，短鏈脂肪酸包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，瘤胃上皮細胞可吸收50%～80%的短鏈脂肪酸，并有報道稱短鏈脂肪酸可影響瘤胃物理屏障和免疫屏障功能，如影響瘤胃上皮的完整性、瘤胃上皮生長、緊密連接的表達以及瘤胃上皮炎癥因子的調(diào)節(jié)等[2].瘤胃內(nèi)注射SCFAs可促進幼齡反芻動物瘤胃乳頭的發(fā)育[3].此外，SCFAs還可以刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，促進機體能量的消耗，減少脂肪的合成等[4].已有研究表明，G蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)和G蛋白偶聯(lián)受體43(G protein-coupled receptor 43,GPR43)是人體短鏈脂肪酸的受體[5-7].GPR41 mRNA廣泛表達于胰臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織器官中，在脂肪組織中更是尤為普遍[8].GPR41/43在胃腸道黏膜和內(nèi)分泌細胞中均有表達，這表明GPR41/43可能參與免疫炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展.目前的研究中，主要是GPR41和GPR43對人和小鼠炎癥反應的調(diào)控[7,15]，SCFA可誘導GPR43的表達，促進小鼠骨髓中性粒細胞的趨化[9].小鼠體內(nèi)注射乙醇可誘導發(fā)生結(jié)腸炎癥，而小鼠在丟失了GPR41和GPR43基因的條件下，腸道白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-12(Interleukin -12,IL-12)的表達量顯著降低[10].以此可以得出，GPR41和GPR43的激活可以增強促炎因子的高表達.目前，GPR41和GPR43已在奶牛的不同組織中被鑒定[11].但本實驗室建立的永生化奶牛瘤胃上皮細胞系不能表達GPR43，只能表達GPR41.并且，科研研究中關(guān)于SCFA用于調(diào)節(jié)瘤胃上皮先天免疫的分子機制研究較少，我們推測SCFA調(diào)節(jié)奶牛瘤胃上皮細胞炎癥反應與GPR41的介導有關(guān).

本試驗在永生化的瘤胃上皮細胞中添加20 mmol/L的短鏈脂肪酸，觀察隨著吸收時間的延長瘤胃上皮細胞中GPR41、促炎因子IL-1β、趨化因子2(CXCL2)、趨化因子3(CXCL3)、趨化因子8(CXCL8)、趨化因子20(CCL20)和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1表達量的變化趨勢，為系統(tǒng)的研究SCFAs調(diào)節(jié)瘤胃上皮免疫機制奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 試驗分為4組，在瘤胃上皮細胞中添加20 mmol/L SCFAs ，0、2、5、8 h時收集細胞，提取總RNA.試驗中乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比為15∶5∶3.20 mmol/L SCFAs由12 mmol/L乙酸鈉、5 mmol/L丙酸鈉和3 mmol/L丁酸鈉組成.

1.2.2 總RNA提取 在奶牛瘤胃上皮細胞中添加SCFAs，分別在0、2、5、8 h后收集細胞，提取各組細胞RNA.棄掉培養(yǎng)基，每孔中加入1 mL的細胞裂解液，靜置5 min，將裂解好的細胞液轉(zhuǎn)移至無酶離心管中；在裂解液中加200 μL的三氯甲烷，閉蓋，混旋10 s，靜置3 min；4 ℃ 12 000 r/minm離心10 min，吸取最上層水相，將其轉(zhuǎn)移到全新無酶離心管中；加入0.5倍體積的無水乙醇，混勻，將溶液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中，4 ℃ 12 000 r/min離心45 s；棄廢液；加入去蛋白液RD 500 μL，4 ℃ 12 000 r/min離心45 s，棄廢液；再加入漂洗液RW 500 μL，靜置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心45 s，棄廢液；重復上述步驟；將吸附柱放回收集管，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min；棄廢液，打開蓋子室溫靜置15 min，徹底去除殘余的有機液體；將吸附柱放置新的1.5 mL無酶離心管中，加30 μL無酶水，靜置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min.測定總RNA的濃度和純度.

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 本試驗使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有操作依據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行.

1.2.4 引物設計與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的奶牛IL-1β、CXCL8、CCL20、CXCL2、CXCL3、Claudin-1、ZO-1、Occludin、GPR41和GAPDH的mRNA序列，采用Primer Premier 6.0軟件進行引物設計，引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1.引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成.

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析.One-Way ANOVA程序進行單因素方差分析，顯著性檢驗應用LSD法.

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 添加SCFAs后對奶牛瘤胃上皮細胞GPR41表達的影響

在奶牛瘤胃上皮細胞中添加20 mmol/L的SCFAs，以不同時間點收集的細胞cDNA為模板，進行qPCR分析.如圖1所示，8 h后GPR41的表達量顯著高于0、2、5 h時的表達量(P<0.05).

圖1 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞GPR41表達的影響Figure 1 Effects of SCFA on expression of GPR41 in BRECs

2.2 添加SCFAs后對奶牛瘤胃上皮細胞促炎因子和趨化因子表達的影響

免疫因子和趨化因子的表達量可反映上皮細胞免疫機能的強弱，瘤胃上皮細胞中添加20 mmol/LSCFAs，不同時間點對免疫機能的影響見下圖，由圖2可知，添加20 mmol/L的SCFAs，2 h時IL-1β的表達量顯著上升，顯著高于0 h時(P<0.05)，在8 h時達到最高.由圖3和圖5可知，添加20 mmol/L SCFAs 5 h時，CXCL2和CXCL8的表達量顯著高于0 h組(P<0.05)，且在整組中表達量最高；CXCL8、CCL20的表達量在5 h時最高，但到了8 h時表達量顯著降低(P<0.05).由圖4可知，CXCL3的表達量隨著時間點的增加表達量逐漸升高，但未達到顯著水平(P>0.05).

圖2 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞IL-1β表達的影響Figure 2 Effects of SCFA on expression of IL-1β in BRECs

圖3 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞CXCL2表達的影響Figure 3 Effects of SCFA on expression of CXCL2 in BRECs

圖4 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞CXCL3表達的影響Figure 4 Effects of SCFA on expression of CXCL3 in BRECs

圖6 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞CCL20表達的影響Figure 6 Effects of SCFA on expression of CCL20 in BRECs

2.3 添加SCFAs后對奶牛瘤胃上皮細胞緊密連接蛋白表達的影響

瘤胃上皮細胞中添加SCFA，對緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin表達量的影響見下圖.由圖7可知，添加20 mmol/L SCFAs ZO-1的表達量在8 h時達到最高，但沒有達到顯著水平(P>0.05).由圖8、9可知，添加20 mmol/L SCFAs 2 h時Claudin-1和Occludin的表達量顯著高于0 h時(P<0.05)，而在5、8 h時，Claudin-1和Occludin的表達量逐漸降低，但均顯著高于0 h(P<0.05).

圖7 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞ZO-1表達的影響Figure 7 Effects of SCFA on expression of ZO-1 in BRECs

圖8 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞Claudin表達的影響Figure 8 Effects of SCFA on expression of Claudin in BRECs

圖9 SCFA對奶牛瘤胃上皮細胞Occludin表達的影響Figure 9 Effects of SCFA on expression of Occludin in BRECs

3 討論

反芻動物瘤胃發(fā)酵的重要產(chǎn)物是短鏈脂肪酸，它可調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)育、胰島素和胰高血糖素分泌以及參與一些重要的生理過程[4].腸道微生物可以積極的調(diào)節(jié)免疫反應預防腸道炎癥疾病的發(fā)生[12-13].患有結(jié)腸炎的病人常常伴隨SCFAs的顯著減少[10].短鏈脂肪酸是反芻動物瘤胃微生物降解日糧中碳水化合物所產(chǎn)生的有機酸[14].因此，我們推斷腸道微生物能夠積極的調(diào)節(jié)免疫反應可能與微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs有關(guān).參與免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的SCFAs可激活GPR41受體.前人已證明，GPR41和GPR43是短鏈脂肪酸的受體[5-6]，這表明GPR41和GPR43作為受體可能同樣介導SCFAs調(diào)控瘤胃上皮炎癥的反應.有研究顯示，瘤胃上皮中GPR41表達量下降，會導致瘤胃上皮屏障的損傷和炎癥反應的發(fā)生[15].一旦瘤胃上皮通透性增加，瘤胃內(nèi)的脂多糖和細菌裂解物就有機會轉(zhuǎn)移到血液中，導致全身出現(xiàn)炎癥反應[16].本試驗在奶牛瘤胃上皮細胞中添加了20 mmol/L的SCFAs，8 h后GPR41的表達量顯著升高，再次驗證了SCFAs和GPR41之間的相互作用關(guān)系.并且本研究發(fā)現(xiàn)加入SCFAs 8 h后GPR41表達量顯著升高，同時IL-1β的表達量也在添加SCFAs 8 h后達到了最高水平，IL-1β在促進中性粒細胞的招募和抵抗金黃色葡萄球菌的感染中扮演十分重要的作用.有研究報道稱，小鼠體內(nèi)GPR41表達量降低可導致促炎因子IL-1β、IL-6、IL-11的表達量降低，并且缺乏GPR41會下調(diào)小鼠腸道炎癥介質(zhì)相關(guān)基因的表達[17].細胞中的趨化因子同樣是瘤胃上皮免疫屏障的重要組成部分，趨化因子可以趨化免疫細胞如巨噬細胞和中性粒細胞到達組織受感染的部位，進行免疫應答來處理異物產(chǎn)生的抗原.奶牛在飼喂高精料的日糧時，可有效提高奶牛的產(chǎn)奶量.于此同時，瘤胃微生物對日糧纖維進行發(fā)酵產(chǎn)生大量有機酸，降低了瘤胃中的pH，破壞革蘭氏陰性菌并釋放游離脂多糖，從而引發(fā)瘤胃上皮組織的炎癥反應，導致反芻動物出現(xiàn)拉稀的癥狀.飼喂高精料日糧雖會產(chǎn)生大量SCFAs，但也會增強瘤胃上皮GPR41的表達量，CCL型和CXCL型趨化因子表達量上調(diào)，促使更多的免疫細胞到達瘤胃上皮層，對瘤胃上皮形成保護性免疫應答.有研究表明，機體組織GPR41的表達量與CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL8以及CXCL14 mRNA的表達量始終呈正相關(guān)[15].在敲除了GPR41基因的小鼠中，腸組織中CCL和CXCL型趨化因子的基因表達量顯著降低，并導致中性粒細胞浸潤異常減少[17].本試驗中添加了20 mmol/L 的SCFAs 8 h時，GPR41的表達量顯著高于0 h，并且CXCL2、CXCL3和CXCL8的表達量也顯著升高，說明添加短鏈脂肪酸通過GPR41的介導可在一定程度上可以增強瘤胃上皮細胞的免疫機能.

瘤胃上皮細胞的連接方式主要分為緊密連接、橋粒連接、黏著連接和間隙連接，而緊密連接形式是細胞間最重要的連接方式[18]，它是防止有害物質(zhì)跨越上皮組織轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵結(jié)構(gòu).胃腸中的這種緊密連接形式主要位于顆粒層細胞之間，是形成胃腸黏膜保護屏障的基礎結(jié)構(gòu)，也是決定細胞間通透性大小的主要因素.大量的研究表明，緊密連接蛋白基因的表達和分布與多種上皮疾病有關(guān)[19].病理狀態(tài)下，緊密連接屏障被破壞，細胞間隙增大，細菌、病毒等大分子物質(zhì)趁機進入，黏膜的屏障功能減弱甚至消失.當上皮組織緊密連接結(jié)構(gòu)發(fā)生變異、減少或缺失時，該組織的緊密連接再分配和基因表達便會下調(diào)，致使上皮細胞受損，屏障功能喪失，進而使上皮細胞通透性增加[20]，如在腸炎時，屏障功能受損過多的水分進入腸腔，造成腹瀉或更嚴重后果，這都是基于上皮組織緊密連接結(jié)構(gòu)的改變和緊密連接蛋白復雜性的降低造成的[21].本試驗在瘤胃上皮細胞中添加20 mmol/L的短鏈脂肪酸，2 h后Claudin-1和Occludin的表達量顯著高于0 h時，而在5 h后Claudin-1和Occludin的表達量有所降低，但表達量仍顯著高于0 h時，說明在瘤胃上皮細胞中添加短鏈脂肪酸短時間內(nèi)便可以增加緊密連接蛋白的表達量.Tong等研究發(fā)現(xiàn)，丙酸和丁酸等可以增加腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表達量，或通過增加AMP-激活蛋白激酶的活性，加速緊密連接組裝，從而加強細胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，抑制腸道通透性，增強屏障防御機能[22-23].Claudin蛋白是上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)中最主要的功能分子，它維持著緊密連接特有的屏障特性，嚴格控制微生物和毒性大分子通過，以此來保持組織內(nèi)部的穩(wěn)態(tài).Occludin蛋白是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)的功能分子之一，但它不是此結(jié)構(gòu)必需的蛋白[24]，它的存在影響Clauddin蛋白的表達，使其更好的形成完整的緊密連接，來履行緊密連接特有的柵欄功能和屏障功能.所以從試驗結(jié)果看短鏈脂肪酸是可以增強瘤胃上皮細胞緊密連接蛋白的表達量，對瘤胃上皮免疫屏障的形成起著積極促進作用.

4 結(jié)論

瘤胃上皮細胞吸收短鏈脂肪酸后，可以上調(diào)GPR41的表達量，提高促炎因子IL-1β和趨化因子的表達量，并且瘤胃上皮細胞中緊密連接蛋白的表達量也顯著升高.炎癥因子、趨化因子、緊密連接蛋白表達量都有所上調(diào)，說明短鏈脂肪酸能夠增強瘤胃上皮的免疫屏障功能.