禹金良 盛致遠(yuǎn) 高玉帥 閆兆月 孫勇 步星耀

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，病死率高，易復(fù)發(fā)，經(jīng)過外科精準(zhǔn)手術(shù)聯(lián)合放、化療治療后效果仍不理想［1］。隨著近年腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，腫瘤的治療逐漸進(jìn)入個體化精準(zhǔn)診療時代，根據(jù)不同分子表型制定特定的治療方案可提高治療效果使患者獲益。據(jù)報道［2］美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的許多分子靶向療法在多種惡性腫瘤（乳腺癌、白血病、結(jié)腸直腸癌、肺癌和卵巢癌）的治療中已有顯著的臨床療效。對膠質(zhì)瘤進(jìn)行精準(zhǔn)個體化治療必須對其進(jìn)行精準(zhǔn)分子學(xué)分型。腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的過程，也是腫瘤基因組改變的動態(tài)過程［3］，大多數(shù)腫瘤在放、化療后會造成新的基因突變［4］，導(dǎo)致腫瘤耐藥，單次的組織分子病理信息不能代表腫瘤演變及基因組變化的過程，臨床上更需要能夠連續(xù)追蹤膠質(zhì)瘤基因組改變更有價值的診斷方法。近年研究腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中發(fā)現(xiàn)了CSF-ctDNA，并可以追蹤膠質(zhì)瘤的演變［5］，比來自血液循環(huán)的循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）更能代表腫瘤的基因改變［6］，而且相對腫瘤組織學(xué)基因檢測更全面、更有意義［7］。腫瘤間質(zhì)液（tumor interstitial fluid，TIF）是浸潤腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞（包括免疫細(xì)胞）的組織間液，潛在的生物標(biāo)志物將以高濃度局部出現(xiàn)在TIF中，并最終在CSF 中被稀釋，可靠地反映出局部腫瘤微環(huán)境TIF的使用，能夠鑒定可用于疾病的早期檢測和監(jiān)測的物質(zhì)［8］。目前國內(nèi)外鮮見采用TIF-ctDNA檢測輔助實體腫瘤診療的研究。本研究采用二代基因測序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)，探討CSF-ctDNA 與TIF-ctDNA 檢測在腦膠質(zhì)瘤中的診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測、腫瘤標(biāo)志物及靶向藥物篩選等方面的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

1.1.1 入組標(biāo)準(zhǔn) 選取2019年1月至12月河南省人民醫(yī)院收治的12例膠質(zhì)瘤患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲，Karnofsky評分（KPS）≥60分；無肺、心、肝、腎等重要臟器功能障礙，血紅蛋白（HGB）≥100 g/L，白細(xì)胞計數(shù)（WBC）＞4×109/L，血小板計數(shù)（PLT）≥100×109/L；術(shù)后腫瘤全切，病理結(jié)果證實為腦膠質(zhì)瘤；術(shù)后無顱內(nèi)血腫、顱內(nèi)感染等嚴(yán)重并發(fā)癥；在本院接受替莫唑胺口服聯(lián)合瘤腔局部化療、術(shù)中置入Ommaya儲液囊的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：曾接受血管表皮生長因子等靶向治療；原發(fā)灶術(shù)前曾接受過化療或免疫治療；曾患其他系統(tǒng)惡性腫瘤。本研究獲得患者知情同意，并簽署書面知情同意書，且經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 病例特征 本研究共收集12例腦膠質(zhì)瘤患者的CSF與TIF配對標(biāo)本。其中男性4例，女性8例；年齡15～65歲，平均年齡（48.1±13.9）歲。根據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（WHOⅣ級）7例（58.3%），少突星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級）1例（8.3%），間變星形細(xì)胞瘤（WHOⅢ級）1例（8.3%），間變少突細(xì)胞瘤（WHOⅢ級）1例（8.3%），星形細(xì)胞瘤（WHOⅡ級）1例（8.3%），室管膜瘤（WHOⅡ級）1例（8.3%）。根據(jù)檢測結(jié)果，1例少突星形細(xì)胞瘤與1例間變星形細(xì)胞瘤未在CSF中未發(fā)現(xiàn)ctDNA突變，1例室管膜瘤在對應(yīng)標(biāo)本中未檢測到CSFctDNA與TIF-ctDNA陽性突變，其他患者均在對應(yīng)標(biāo)本中檢測到ctDNA突變。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 術(shù)中采用多模態(tài)影像融合神經(jīng)導(dǎo)航和功能定位檢測技術(shù)，最大范圍安全切除腫瘤組織，將Ommaya 儲液囊植入，連接管端放置腫瘤殘腔中，儲液囊端固定于帽狀腱膜下。依據(jù)中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南（2015 版），對于低級別膠質(zhì)瘤術(shù)后采用放療（高危患者）聯(lián)合替莫唑胺同步和輔助化療；高級別膠質(zhì)瘤在標(biāo)準(zhǔn)的STUPP 治療方案基礎(chǔ)上，瘤腔局部化療。

1.2.2 標(biāo)本獲取 手術(shù)結(jié)束3 個月后開始收集患者CSF與TIF標(biāo)本，于當(dāng)月次化療周期開始前1天收集，同時取患者CSF 標(biāo)本8.0～12.0 mL、TIF 標(biāo)本0.5～1.0 mL、血液標(biāo)本5.0 mL，并存入-80°冰箱。血液標(biāo)本取自周圍靜脈血。CSF 標(biāo)本通過腰穿獲?。▓D1）。TIF 標(biāo)本獲?。▓D2）操作步驟：剔除Ommaya 儲液囊周圍毛發(fā)，酒精紗布擦拭儲液囊周圍，除去油脂等雜質(zhì)，碘伏消毒3 遍，消毒范圍為儲液囊周圍3.0～5.0 cm；戴無菌手套固定穿刺點，用1.0 mL 注射器經(jīng)皮穿刺Ommaya儲液囊，緩慢抽出儲液囊內(nèi)或腫瘤殘腔的液體0.5～1.0 mL，抽針，棉球按壓止血2 min。

1.2.3 ctDNA的提取 所有臨床收集的CSF樣本、TIF樣本及血液樣本均使用NGS技術(shù)進(jìn)行檢測，CSF、TIF測序深度為20 000X，對照血液白細(xì)胞測序深度為250X。樣本在EDTA管中用13 000 r/min離心機，離心10 min，沉淀顆粒-80℃凍存。而上清則以12 000 r/min離心機，離心10 min，TIF測序深度為20 000X，轉(zhuǎn)移至超低溫管-80℃保存。上清液采用MagMAXTMCellFree DNA分離試劑盒（Thermo Fisher Scientific，美國）提取cfDNA（cellfree DNA）。最后使用Qubit dsDNA HS分析試劑盒（Life Technologies，美國），Qubit 2.0熒光儀對所有分離的DNA進(jìn)行量化分析。

1.2.4 基因文庫的構(gòu)建及測序 利用Covaris M220聚焦超聲檢測儀（Covaris，美國）將基因組DNA 剪切成150～200 bp 片段，采用KAPA Hyper 文庫準(zhǔn)備試劑盒（KK8504，Illumina 平臺，美國）對ctDNA 進(jìn)行文庫構(gòu)建，連接可供測序儀識別的接頭序列，以及用于區(qū)分于不同樣本的標(biāo)簽序列；使用SureSelectQXT Re?agent試劑盒（G96838，美國）進(jìn)行文庫的捕獲，并富集目的片段，得到足量的測序文庫，進(jìn)行qRCR（實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)）檢測確定有效濃度，按照測序數(shù)量比例混合為1 個pooling 文庫運用NovaSeq 6000 S4 Reagent 試劑盒（300 cycles，Illumina 平臺，美國）上機測序，獲得下機數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用秩和檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 采用腰穿收集腦膠質(zhì)瘤患者的CSF標(biāo)本

圖2 經(jīng)皮Ommaya儲液囊穿刺獲取患者的TIF標(biāo)本

2 結(jié)果

2.1 基因檢測結(jié)果

12例膠質(zhì)瘤患者中共檢測到57種不同類別的變異基因共209 個，樣本總平均突變數(shù)為8.7 個，CSFctDNA 平均突變數(shù)為4.3 個，TIF-ctDNA 平均突變數(shù)為13 個。CSF-ctDNA 樣本中3 例未檢測出陽性結(jié)果，陽性率為75.0%（9 例）；TIF-ctDNA 樣本中1 例未檢測出陽性結(jié)果，陽性率為91.6%（11 例）。TIF-ctD?NA中共檢測到55種類型的基因突變，其中改變最頻繁的基因TP53 5 例（41.6%），SETD2 5 例（41.6%），EGFR 4 例（33.3%），F(xiàn)AT1 4 例（33.3%），RELA 4 例（33.3%），DAXX 4 例（33.3%），IDH1 4 例（33.3%）。CSF-ctDNA 中檢測到25 種類型的基因突變，其中改變最頻繁的基因為TP53 5 例（41.6%），SETD2 5 例（41.6%），F(xiàn)AT1 4例（33.3%），EGFR 3例（25.0%），RE?LA 3 例（25.0%），IDH1 3 例（25.0%），NF1 3 例（25.0%），PTEN 3 例（25.0%）。兩種方式均檢測到膠質(zhì)瘤中一些常見的基因突變，如KRAS、TP53、EGFR、IDH、ATRX、PTEN，均為膠質(zhì)瘤的潛在腫瘤標(biāo)志物。檢測出IDH1突變的4個樣本分別來自間變星形細(xì)胞瘤、間變少突細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤與高級別膠質(zhì)瘤患者各1例。TP53突變的5個樣本分別來自3例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、間變少突細(xì)胞瘤與星形細(xì)胞瘤患者。檢測出SETD2突變的5個樣本來自4例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與1例星形細(xì)胞瘤患者。EGFR突變的4個樣本來自3例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與1例星形細(xì)胞瘤患者。ATRX突變來自膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、間變少突細(xì)胞瘤與星形細(xì)胞瘤患者各1 例。BRAF 變異來自1 例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者?；颊逤SF與TIF樣本基因突變頻數(shù)見圖3。

圖3 12例膠質(zhì)瘤患者的基因突變數(shù)

2.2 復(fù)發(fā)與生物信息學(xué)分析

本研究中5 例患者在檢測后2～4 個月內(nèi)影像學(xué)發(fā)現(xiàn)不同程度的腫瘤復(fù)發(fā)，患者ctDNA 檢測發(fā)現(xiàn)TP53、EGFR 或SETD2 基因突變，較影像學(xué)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)時間平均提前2.9個月（圖4）。經(jīng)過生物信息學(xué)分析在57 種不同類別的基因變異中，突變基因PIK3CA、PTEN、KRAS、EGFR、TP53、NF1、BRCA1、BRCA2、TSC1、TSC2、IDH1、CDKN2A 匹配到靶向潛在獲益藥物，突變基因PIK3CA、KRAS、EGFR 匹配到潛在耐藥藥物（表1）。

圖4 5例膠質(zhì)瘤患者影像學(xué)表現(xiàn)

表1 突變基因靶向藥物

2.3 標(biāo)本ctDNA濃度

本研究CSF 與TIF 標(biāo)本中，ctDNA 濃度有較大差異。來自同1例患者的ctDNA濃度TIF樣本高于CSF樣本，12 例患者的CSF 標(biāo)本ctDNA 平均濃度為0.58 ng/μL，TIF 標(biāo)本ctDNA 平均濃度為3.38 ng/μL，明顯高于CSF標(biāo)本中ctDNA平均濃度，對比有顯著性差異（P=0.002）。CSF與TIF檢測到的基因突變頻率，測序深度均為20 000X，單CSF-ctDNA 檢測到2 種突變類型，單TIF-ctDNA檢測到32種突變類型，二者共同檢測到23 種突變類型，TIF-ctDNA 檢測到的基因類別、突變量均明顯高于CSF-ctDNA（圖5）。TIFctDNA 檢測效力更高，相對CSF-ctDNA 檢測陽性率高，能夠提供更多、更全面的腫瘤基因組信息。

3 討論

近年來隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，對膠質(zhì)瘤在臨床中指導(dǎo)價值較大的某些基因被逐漸挖掘，如IDH、MGMT、EGFR、TERT等。然而由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)存在不一致性，隨著腫瘤的進(jìn)展及放化療的進(jìn)行，腫瘤基因表達(dá)發(fā)生改變，突變基因不斷發(fā)生變化，而腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行精準(zhǔn)靶向治療，需要可以動態(tài)監(jiān)測基因變化的方法。由于腦部位置特殊，手術(shù)風(fēng)險大、費用高，對患者多次開顱活檢操作，患者及家屬多不能接受，在臨床上限制性較大。游離于血液、腦脊液或組織間質(zhì)液中的ctDNA是各個腫瘤組織脫落的混合體，取樣方便、快捷、安全，能夠在腫瘤進(jìn)展過程中多次取樣，可以克服腫瘤組織的空間異質(zhì)性，ctDNA取代手術(shù)活檢標(biāo)本，為腫瘤診斷和突變分析提供了一種可靠方法［9］。由于血腦屏障的存在，導(dǎo)致血清中ctDNA的檢出十分有限［6］，血清ctDNA并不能提供腦腫瘤患者足夠的遺傳信息。前期多項研究數(shù)據(jù)表明，CSF-ctDNA相較于血清ctDNA具有更高的組織一致性［10-11］。有研究［6］利用大規(guī)模NGS測序技術(shù)比較12例腦腫瘤患者CSF和血漿中的特異性ctDNA，發(fā)現(xiàn)相比血清，IDH1（R132H）、TP53（R114C）、ANK2（K2337X）在CSF中被檢出率更高，更能有效地反映腫瘤進(jìn)展及其對治療的反應(yīng)。

圖6 CSF-ctDNA與TIF-ctDNA檢測到的基因突變頻率

CSF-ctDNA 研究有助于膠質(zhì)瘤患者早期診斷、篩選靶向藥物、早期檢測腫瘤復(fù)發(fā)。Martínez-Ricarte等［12］研究分析來自癌癥基因組圖譜（TCGA）的2個腫瘤組（包括648 例彌漫性膠質(zhì)瘤）的IDH1、IDH2、TP53、TERT、ATRX、H3F3A 和HIST1H3B 基因突變，對20 例膠質(zhì)瘤患者的臨床腫瘤標(biāo)本及CSF 中此7 個基因進(jìn)行的靶向外顯子測序和微滴式數(shù)字PCR（ddP?CR）分析發(fā)現(xiàn)，CSF-ctDNA可對腫瘤進(jìn)行準(zhǔn)確的組織病理分型。Pentsova 等［13］使用MSK-IMPACT 技術(shù)在肺癌腦轉(zhuǎn)患者的CSF中鑒定出多種耐藥突變，如EG?FR T790M 等，為此類患者提供了靶藥指導(dǎo)。本研究中，PIK3CA、PTEN、KRAS、EGFR、TP53等突變基因為患者匹配到靶向潛在獲益藥物；PIK3CA、KRAS、EG?FR 突變基因匹配到潛在耐藥藥物，對臨床靶向治療具有指導(dǎo)作用。目前的影像學(xué)技術(shù)只能待腫瘤增長至一定體積時做出復(fù)發(fā)判斷，無法在腫瘤發(fā)生分子改變的早期做出復(fù)發(fā)診斷。ctDNA 檢測可在影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)時在分子水平發(fā)現(xiàn)腫瘤基因突變，本研究中ctDNA 在分子水平發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)較影像學(xué)發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)早2.9個月。

雖然CSF-ctDNA 有助于膠質(zhì)瘤的早期診斷、篩選靶向藥物、早期檢測腫瘤復(fù)發(fā)，然而腫瘤DNA脫落進(jìn)入CSF并非是腦膠質(zhì)瘤的普遍特征。游離DNA的數(shù)量和組成受許多因素影響，包括癌癥的分期和解剖位置、腫瘤亞克隆的相對質(zhì)量、生長速率、基質(zhì)和炎性成分、腫瘤細(xì)胞死亡和壞死的程度。因此，CSF來源的ctDNA檢測在臨床應(yīng)用上存在一定的局限性，無法檢測到更多的突變基因，檢測陽性率低，此與本研究結(jié)果相符。由于TIF 是直接來源于術(shù)后可能存在的殘存腫瘤組織或者原位復(fù)發(fā)的腫瘤組織，TIF作為膠質(zhì)瘤分子基因圖譜檢測的樣本，不存在CSFctDNA 的空間分泌障礙和低級別膠質(zhì)瘤的時空發(fā)展局限，能夠更直接反映當(dāng)下腫瘤的真實分子生物學(xué)背景信息。Yang等［14］通過從殘留積液上清液中分離的cfDNA進(jìn)行基于雜交捕獲的NGS，評估了漿液腔液中cfDNA的分子特征和臨床病理相關(guān)性，證明了從漿液腔液中分離的cfDNA 進(jìn)行的液體活檢能夠為實體腫瘤基因分型提供新的來源。Panditharatna 等［15］分析了1例彌漫性中線膠質(zhì)瘤患者死后的腫瘤囊腫液、CSF和腫瘤基因組DNA，發(fā)現(xiàn)囊液中含有大量的組蛋白突變體DNA，表明囊液中含有大量的腫瘤DNA。由于腦膠質(zhì)瘤術(shù)腔間質(zhì)液是直接浸透膠質(zhì)瘤周圍腦組織細(xì)胞的液體微環(huán)境，瘤周組織細(xì)胞通過細(xì)胞膜和間質(zhì)液發(fā)生物質(zhì)交換，而且腫瘤原發(fā)灶殘存或復(fù)發(fā)壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞降解后的產(chǎn)物可直接釋放進(jìn)入間質(zhì)液。因此，腦膠質(zhì)瘤術(shù)腔間質(zhì)液ctDNA可直接精準(zhǔn)反映原發(fā)腫瘤原發(fā)灶殘存、復(fù)發(fā)腫瘤基因變異或突變的特點，其絕對含量隨著腫瘤負(fù)荷和治療反應(yīng)而發(fā)生敏感變化，其檢測結(jié)果更具有代表性。本研究結(jié)果表明TIF-ctDNA 比CSF-ctDNA 樣本中ctDNA 濃度更高，檢測到的突變類型更多，檢測陽性率更高，更能真實反映腫瘤復(fù)發(fā)過程中基因表達(dá)的變化。

綜上所述，CSF-ctDNA、TIF-ctDNA 均可作為在膠質(zhì)瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的過程中能夠反復(fù)檢測、篩選膠質(zhì)瘤標(biāo)志物的一種可靠檢測方法，對膠質(zhì)瘤患者基因診斷、早期檢測復(fù)發(fā)、篩選腫瘤標(biāo)志物及靶向治療具有一定臨床意義。而TIF-ctDNA 較CSF-ctDNA 檢測獲得樣本ctDNA濃度更高，檢測患者基因平均突變數(shù)與檢測陽性率更高、檢測效力更高，能夠提供更多、更全面的腫瘤基因組信息，適合臨床用于獲取膠質(zhì)瘤的基因表達(dá)信息。