全秀蓮，朱金明，陳曦，張宇，冀學(xué)寧

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，遼寧大連 116001

三陰性乳腺癌是指HER-2、雌激素和孕激素受體均為陰性的乳腺癌，其惡性程度高，侵襲能力強(qiáng)，臨床治療效果差，是預(yù)后最差的乳腺癌類型，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。因此，迫切需要明確三陰性乳腺癌潛在的分子機(jī)制，并尋找新的生物靶標(biāo)，改善臨床結(jié)局。90%腫瘤存在染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的異常改變，這種現(xiàn)象又被稱為染色體不穩(wěn)定，有些甚至出現(xiàn)在癌前病變和原位癌階段，這有利于腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移[2]。DSN1是動(dòng)粒蛋白結(jié)構(gòu)核心成分，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中連接紡錘體與染色體，精準(zhǔn)調(diào)控染色體分離過(guò)程[3]。研究[4,5]表明，DSN1與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，可影響腫瘤的細(xì)胞周期和生物學(xué)復(fù)制過(guò)程。但DSN1在乳腺癌中的表達(dá)和功能仍不清楚。本研究觀察了三陰性乳腺癌組織中DSN1的表達(dá)情況，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院2012年1月～2015年12月接受手術(shù)切除的120例三陰性乳腺癌患者?；颊呔鶠榕?，年齡(46.7±11.3)歲，BMI≥28 kg/m267例、<28 kg/m2為53例，腫瘤直徑<2 cm 39例、≥2 cm 81例，組織學(xué)類型中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌91例、浸潤(rùn)性小葉癌9例、髓樣癌3例、其他17例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期67例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移18例、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移102例。所有患者經(jīng)兩位病理醫(yī)師首次明確診斷為三陰性乳腺癌且術(shù)前未接受化療或放療。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者除患乳腺癌外，不存在其他部位的惡性腫瘤；心肝腎功能能耐受手術(shù)；存在完整的臨床病歷資料和隨訪信息；不存在任何遺傳性疾病。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

1.2 三陰性乳腺癌組織中DSN1檢測(cè)方法 手術(shù)切除所有患者腫瘤組織，石蠟包埋，用甲醛固定切成4 μm切片，脫蠟并在梯度乙醇中再水合。在pH6.0的乙二胺四乙酸緩沖液中煮沸切片3 min進(jìn)行抗原修復(fù)。用3%過(guò)氧化氫淬滅內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性30 min。使用兔單克隆抗DSN1抗體(ab184441，Abcam，Cambridge，UK)在4 ℃下將TMA載玻片染色過(guò)夜，再與辣根過(guò)氧化物酶綴合的抗兔二抗(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)在37 ℃溫育30 min。然后使用辣根過(guò)氧化物酶和3,3′-二氨基聯(lián)苯胺色原溶液處理載玻片并用蘇木精復(fù)染。采用陽(yáng)性染色細(xì)胞的百分比結(jié)合染色強(qiáng)度半定量地對(duì)DSN1表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度陰性計(jì)為0分，弱陽(yáng)性計(jì)為1分，中度陽(yáng)性計(jì)為2分，強(qiáng)陽(yáng)性計(jì)為3分。DSN1陽(yáng)性細(xì)胞的百分比占0～10%計(jì)為1分，>10%～50%計(jì)為2分，>50%～80%計(jì)為3分，>80%計(jì)為4分。將兩者得分相乘，≤3為DSN1低表達(dá)，≥4為DSN1高表達(dá)。

1.3 隨訪方法 采用定期返院復(fù)診及電話進(jìn)行隨訪，術(shù)后半年內(nèi)每2個(gè)月復(fù)診1次，半年后每3個(gè)月復(fù)診一次，每月電話隨訪1次。記錄所有患者的總生存時(shí)間(從手術(shù)到患者死亡的時(shí)間；如患者健在，則為從手術(shù)到最后一個(gè)隨訪日的時(shí)間)及無(wú)瘤生存時(shí)間(從手術(shù)到首次隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或隨訪截止日之間的時(shí)間)。計(jì)算5年無(wú)瘤生存率(術(shù)后5年未復(fù)發(fā)的患者人數(shù)/總患者人數(shù)×100%)和5年總生存率(術(shù)后5年仍健在的患者人數(shù)/總患者人數(shù)×100%)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析三陰性乳腺癌患者癌組織中DSN1表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三陰性乳腺癌組織中DSN1的表達(dá)情況 三陰性乳腺癌組織中DSN1蛋白陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)。120例患者中75.8%(91/120)DSN1高表達(dá)、24.2%(29/120)DSN1低表達(dá)。

2.2 DSN1表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果見表1。

2.3 DSN1表達(dá)與三陰性乳腺癌預(yù)后的關(guān)系 DSN1高表達(dá)者5年無(wú)瘤生存率和總生存率分別為12.4%(11/91)、18.7%(17/91)，DSN1低表達(dá)者5年無(wú)瘤生存率和總生存率分別為17.2%(6/29)、24.1%(7/29)，DSN1高表達(dá)者無(wú)瘤生存率和總生存率均低于DSN1低表達(dá)者(P均<0.01)。

單因素Cox回歸分析顯示，DSN1表達(dá)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與三陰性乳腺癌患者無(wú)瘤生存率有關(guān)(P均<0.05)；多因素Cox回歸分析表明，DSN1表達(dá)(HR=1.091，95%CI：1.082～3.75，P=0.001)是三陰性乳腺癌患者無(wú)瘤生存率獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；見表2。

單因素Cox回歸分析顯示，DSN1表達(dá)、TNM分期與三陰性乳腺癌患者總生存率有關(guān)(P均<0.05)；多因素Cox回歸分析表明，DSN1表達(dá)(HR=1.887,95%CI：1.591～4.528,P=0.003)、TNM分期(HR=1.368，95%CI：0.577～2.734，P=0.013)可作為三陰性乳腺癌患者總生存率的預(yù)測(cè)因子；見表3。

表1 DSN1表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

三陰性乳腺癌ER、PR受體和HER-2存在表達(dá)缺陷，內(nèi)分泌和靶向治療效果差，該型腫瘤侵襲力強(qiáng)，傳統(tǒng)治療效果欠佳，是乳腺癌治療領(lǐng)域的難點(diǎn)[2,6,7]。癌癥的出現(xiàn)是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果，染色體的異常改變是腫瘤出現(xiàn)的常見原因[2]。染色體的適當(dāng)分離對(duì)于遺傳物質(zhì)的傳遞十分重要，動(dòng)粒蛋白為染色體分離提供動(dòng)力，精準(zhǔn)時(shí)序調(diào)控染色體分離過(guò)程；DSN1是人體細(xì)胞有絲分裂中動(dòng)粒蛋白組裝所必需的蛋白，動(dòng)粒組裝是染色體分離的關(guān)鍵步驟，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展十分關(guān)鍵[8]。

最近研究表明，DSN1與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤進(jìn)展有關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中64.2%呈現(xiàn)DSN1高表達(dá)，35.3%呈現(xiàn)DSN1低表達(dá)[4]。亦有報(bào)道肺癌組織中DSN1存在高表達(dá)現(xiàn)象[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，120例三陰性乳腺癌患者中75.8% DSN1高表達(dá)，24.2% DSN1低表達(dá)。這些研究結(jié)果說(shuō)明，在肝癌、肺癌、乳腺癌組織都出現(xiàn)了DSN1高表達(dá)，提示DSN1有可能成為新的腫瘤標(biāo)記物，為臨床腫瘤的診治提供新的思路。

研究發(fā)現(xiàn)，DSN1與肝癌[4]、肺癌[9]、結(jié)腸癌[3]的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的侵襲進(jìn)展密切相關(guān)。有文獻(xiàn)[4]報(bào)道,在肝細(xì)胞癌患者中，DSN1高表達(dá)可為肝細(xì)胞癌術(shù)后總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有學(xué)者檢測(cè)了結(jié)直腸癌癌組織和癌旁組織中基因的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)DSN1高表達(dá)且可區(qū)分正常結(jié)腸組織和癌變組織，但其并未探討DSN1高低表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響[3]。本研究發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌組織中的DSN1表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與年齡、肥胖、腫瘤直徑、組織學(xué)類型和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，DSN1高表達(dá)三陰性乳腺癌患者腫瘤顯示出更高的惡性程度。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，DSN1高表達(dá)三陰性乳腺癌患者的預(yù)后低于DSN1低表達(dá)患者，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析提示DSN1表達(dá)為患者無(wú)瘤生存率和總生存率獨(dú)立預(yù)后因素。提示DSN1高表達(dá)是三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是可能預(yù)測(cè)三陰性乳腺癌預(yù)后新的分子標(biāo)志物。亦有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌HER2陽(yáng)性和陰性的基因結(jié)構(gòu)變化是不一致的,在HER2陰性的乳腺癌基因測(cè)序中能夠明顯發(fā)現(xiàn)DSN1基因擴(kuò)增，推測(cè)有可能是DSN1基因擴(kuò)增促進(jìn)HER2表達(dá)陽(yáng)性的改變發(fā)生[10]。這些為后續(xù)深入挖掘DSN1作為乳腺癌的生物靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)。

表2 三陰性乳腺癌患者無(wú)瘤生存率預(yù)測(cè)因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

表3 三陰性乳腺癌患者總生存率預(yù)測(cè)因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析

DSN1高表達(dá)和三陰性乳腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)的機(jī)制尚不清楚，其可能機(jī)制為染色質(zhì)的不穩(wěn)定導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)的不穩(wěn)定。染色體分離過(guò)程出現(xiàn)異常或染色體錯(cuò)配則會(huì)導(dǎo)致多倍體或突變發(fā)生，即出現(xiàn)基因不穩(wěn)定性[11,12]，這是腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的重要原因。調(diào)控動(dòng)粒蛋白能對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移造成重大影響[13～15]。DSN1缺乏的腫瘤細(xì)胞能夠觀察到染色體錯(cuò)位和有絲分裂延遲；DSN1敲除的腫瘤細(xì)胞仍然能夠存活，但其惡性細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力大大下降[16]。DSN1在三陰性乳腺癌方面的機(jī)制是否涉及有絲分裂或其他特定機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上可見，DSN1在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)，且與患者TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；DSN1高表達(dá)是三陰性乳腺癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能是預(yù)測(cè)三陰性乳腺癌預(yù)后新的分子標(biāo)志物。但本研究納入樣本量少，存在一定局限性，DSN1影響三陰性乳腺癌患者預(yù)后的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。