陳锃嶧，陳清貴，龍竹梅，姚思羽，張貴鋒，梁燕龍,2

1肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,廣東肇慶 526061；2肇慶學(xué)院

2型糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(T2DOP)是糖尿病在骨骼系統(tǒng)引起的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，已成為常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥疾病，可導(dǎo)致骨折，給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)壓力[1]。當(dāng)前治療骨質(zhì)疏松的一線藥物如二膦酸鹽類可發(fā)揮一定的療效，但長期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生較多不良反應(yīng)。而中藥具有療效確切、不良反應(yīng)少和患者的認(rèn)可度高等優(yōu)勢(shì)，從中藥中尋找有效成分用于治療骨質(zhì)疏松成為近年來的研究熱點(diǎn)。許多研究表明，芹菜素具有多種藥理學(xué)活性，如抗氧化[2]、抗炎[3]、降血糖[4]和抗癌活性等。最新研究[5]表明，芹菜素對(duì)骨重建具有重要作用，對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有良好的治療效果。但是，芹菜素對(duì)T2DOP的作用少見報(bào)道。因此，2018年7月～2019年5月本研究探討了芹菜素對(duì)2型糖尿病大鼠脛骨和腰椎骨密度的影響，為芹菜素防治T2DOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為T2DOP的臨床防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑和儀器 50只8周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購買于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠飼養(yǎng)在普通級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，實(shí)驗(yàn)室溫度(22.0±3.0)℃，相對(duì)濕度(60.0±5.0)%，實(shí)驗(yàn)開始前所有動(dòng)物進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，普通飼料喂養(yǎng)，不限制進(jìn)食和飲水。芹菜素購自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司；骨化三醇購自上海羅氏制藥有限公司；鏈脲佐菌素購自美國Sigma公司。雙能X線骨密度儀為Discovery QDR系列。

1.2 動(dòng)物造模、分組及處理 50只SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，分別是正常組(10只)和模型組(40只)。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高糖高脂飼料進(jìn)行喂養(yǎng)[6]。造模1個(gè)月后，每只大鼠腹腔注射3%鏈脲佐菌素40 mg/kg，3 d后對(duì)大鼠進(jìn)行葡萄糖耐受試驗(yàn)。在此期間對(duì)大鼠禁食、禁水10 h，之后記錄其體質(zhì)量；以20%的葡萄糖溶液對(duì)大鼠灌胃，控制劑量為5 mL/kg，記錄大鼠的灌胃反應(yīng)；在灌胃前及灌胃后0.5、1、2 h測(cè)血糖，從中選擇餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或空腹血糖≥7.0 mmol/L的30只大鼠納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。該30只大鼠根據(jù)體質(zhì)量排序分3個(gè)區(qū)間，通過軟件得到30個(gè)隨機(jī)數(shù)對(duì)應(yīng)于體質(zhì)量，對(duì)各組的隨機(jī)數(shù)基于大小進(jìn)行標(biāo)序，所有相同標(biāo)序號(hào)的為一組；據(jù)此將所有大鼠分為以下三組：模型組、芹菜素組、骨化三醇組，各組數(shù)量均等。芹菜素組以芹菜素50 mg/(kg·d)連續(xù)灌胃，骨化三醇組以骨化三醇0.045 μg/(kg·d)連續(xù)灌胃。芹菜素和骨化三醇不溶于水，用1%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液。正常組和模型組給予灌胃等體積1%羧甲基纖維素鈉(5 mL/kg)，芹菜素組、骨化三醇組灌胃等體積相應(yīng)藥物，各組連續(xù)灌胃時(shí)間均為8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死所有大鼠。收集血液樣本和骨組織，所有血液樣本于4 ℃冰箱中靜置4 h后離心(10 000 r/min,10 min)，吸取血清裝入EP管-80 ℃保存待用。

1.3 觀察指標(biāo) ①在實(shí)驗(yàn)期間，每2周測(cè)量各組大鼠的空腹血糖和體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠隔夜禁食12 h以上，在次日早晨通過大鼠尾靜脈采血的方式，運(yùn)用血糖儀測(cè)定空腹血糖水平。②將置于-80 ℃冰箱的血清取出，并放在4 ℃環(huán)境下解凍，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法測(cè)定骨鈣素(OCN)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-Ⅰ)和胰島素(INS)水平。操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。③取大鼠脛骨和第2～5腰椎骨(L2～L5)，去除多余組織，將紗布用生理鹽水沾濕，將樣品按照一定的方法進(jìn)行嚴(yán)密包裹，外面再包裹一層錫箔紙，確保樣本組織濕潤，之后將其放入冰箱冷藏，測(cè)定骨密度。從冰箱中取出脛骨和L2～L5，室溫自然解凍，用雙能X線骨密度儀測(cè)定骨密度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠處理前后不同時(shí)間體質(zhì)量比較 見表1。

表1 各組大鼠處理前后不同時(shí)間體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠處理前后不同時(shí)間空腹血糖比較 見表2。

表2 各組大鼠處理前后不同時(shí)間空腹血糖比較

2.3 實(shí)驗(yàn)8周各組大鼠血清INS、OCN、CTX-Ⅰ水平比較 見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)8周各組大鼠血清INS、OCN、CTX-Ⅰ水平比較

2.4 實(shí)驗(yàn)8周各組大鼠腰椎和脛骨骨密度比較 見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)8周各組大鼠腰椎和脛骨骨密度比較

3 討論

T2DOP是糖尿病在骨骼系統(tǒng)引起的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥，已成為常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥疾病，可導(dǎo)致骨折，給社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)壓力[1]。本研究制備的大鼠模型可以很好地模擬人類T2DOP疾病的性質(zhì)和進(jìn)展。本研究的結(jié)果已證實(shí)，該模型大鼠的空腹血糖升高，INS分泌增加，這些與2型糖尿病患者的主要癥狀相似。研究[8]發(fā)現(xiàn)，血糖升高可對(duì)多種體內(nèi)的微量元素代謝造成影響，并且改變破骨細(xì)胞的活躍度。在此情況下，骨細(xì)胞的增殖、分化受到抑制，并進(jìn)一步造成骨量的大量流失，從而對(duì)人體健康造成嚴(yán)重的損害。此外，糖尿病患者INS水平降低也與骨質(zhì)疏松癥骨脆性增加有關(guān)[9,10]。本研究結(jié)果也顯示，高脂高糖飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素制備的2型糖尿病大鼠骨量下降，表明2型糖尿病大鼠骨形成受到抑制，松質(zhì)骨出現(xiàn)骨丟失，導(dǎo)致骨量降低，其大鼠血清骨代謝指標(biāo)OCN水平升高和CTX-Ⅰ水平降低也能解釋上述的結(jié)果。

芹菜素是一種天然植物類黃酮，可降低血糖和改善血脂異常。研究[11]表明，芹菜素可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。從這一角度出發(fā)，本研究探討50 mg/(kg·d)劑量的芹菜素對(duì)2型糖尿病大鼠脛骨和腰椎骨密度的影響。既往研究已證實(shí)，該劑量能夠?qū)?shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠具有保護(hù)作用[4]，并緩解糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。本研究結(jié)果可見，芹菜素能夠明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖和INS水平，這與其他文獻(xiàn)的研究[12]結(jié)果具有一致性，其作用效果與陽性藥骨化三醇組相當(dāng)。同時(shí)，在給藥6周和8周時(shí)發(fā)現(xiàn)，芹菜素組大鼠體質(zhì)量均高于模型組，這表明芹菜素發(fā)揮著降血糖作用，從而使葡萄糖不會(huì)從大鼠尿中過多丟失，加之大鼠食欲旺盛，導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量增加。2型糖尿病大鼠灌胃芹菜素8周后，大鼠血清骨代謝轉(zhuǎn)換指標(biāo)中OCN水平升高，CTX-Ⅰ水平降低，說明芹菜素能夠促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收，有助于增加骨量。從醫(yī)學(xué)上講，骨密度與骨強(qiáng)度直接相關(guān)，也是診斷骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)；此外，也可以根據(jù)人體骨密度情況預(yù)測(cè)骨折風(fēng)險(xiǎn)[13]。根據(jù)相關(guān)研究結(jié)果顯示，芹菜素能提高去勢(shì)大鼠股骨骨密度，同時(shí)也可以一定程度的預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生[14]。本研究結(jié)果顯示，芹菜素對(duì)2性糖尿病大鼠脛骨和腰椎的骨密度水平均有明顯提升，其作用機(jī)制有可能與芹菜素具有調(diào)控Wnt/β-catenin通路表達(dá)的作用有關(guān)[15]，因?yàn)樵谔悄虿⌒∈竽Ｐ椭?，骨量的丟失與Wnt/β-catenin通路調(diào)控下降有直接相關(guān)[16]。

總之，芹菜素可提高糖尿病大鼠腰椎、脛骨的骨密度，這為芹菜素防治T2DOP提供了理論依據(jù)。但T2DOP發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，本研究給藥干預(yù)的時(shí)間僅8周，所得結(jié)果可能存在一定局限性，未來應(yīng)該進(jìn)一步延長藥物干預(yù)時(shí)間，同時(shí)重點(diǎn)研究其分子水平和骨生物力學(xué)作用。