曹璇，鄭曉冬

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）是一類好氧菌，在25～30 ℃條件下可以快速生長(zhǎng)。YAN等發(fā)現(xiàn)，從果園土壤中分離出的季也蒙畢赤酵母菌株（Y1）可以直接抑制梨果實(shí)表面擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）的生長(zhǎng)[1]；高云慨等發(fā)現(xiàn)，從海南杧果園取樣分離到的季也蒙畢赤酵母菌株（LZ5）對(duì)杧果采后炭疽病菌有明顯的抑制效果[2]；丁玥等的試驗(yàn)證明，季也蒙畢赤酵母可以有效控制番茄貯藏期灰霉病的發(fā)生[3]。同時(shí)，RANGARAJAN等[4]、SIM等[5]、SHARMA等[6]的研究證明，部分生防菌種經(jīng)外界逆境脅迫培養(yǎng)后，可以明顯增強(qiáng)其對(duì)農(nóng)作物或果蔬采后病害的防治效果。由于季也蒙畢赤酵母對(duì)果蔬采后具有較好的生物防治效果，近年來受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。筆者所在實(shí)驗(yàn)室曾于海南省三沙市西沙群島海沙中分離得到1株季也蒙畢赤酵母（保藏號(hào)：CGMCC 17240），試驗(yàn)證明此酵母菌株對(duì)櫻桃番茄果實(shí)灰霉病有一定的抑制作用，并且試驗(yàn)還證明該酵母菌株有一定的耐鹽性，在12%NaCl脅迫培養(yǎng)條件下仍可生長(zhǎng)，且經(jīng)鹽逆境脅迫培養(yǎng)后其生防效果有所提升。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是了解基因組遺傳信息與生物功能的橋梁[7]，使用Illumina公司高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可以在不需要知道物種基因組詳細(xì)信息的條件下獲得某一物種在特定狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本的序列信息[8-9]。且轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)會(huì)隨著生物體的生長(zhǎng)發(fā)育情況及所處環(huán)境狀態(tài)發(fā)生變化，因此，對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析可以幫助我們有效研究生物在逆境脅迫下應(yīng)激生理的作用機(jī)制[10]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)鹽脅迫與未經(jīng)鹽脅迫培養(yǎng)后的M.guilliermondii 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）功能注釋及京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，旨為M.guilliermondii的耐鹽機(jī)制及其進(jìn)一步研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）為筆者所在實(shí)驗(yàn)室于海南省西沙群島海沙中分離得到，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCC 17240。

1.1.2 樣品制備

從保藏斜面上挑取少許季也蒙畢赤酵母接種于營(yíng)養(yǎng)酵母葡萄糖瓊脂（nutrient yeast dextrose agar,NYDA）固體培養(yǎng)基（牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，瓊脂20 g，用水定容至1 000 mL，于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min）上，25 ℃靜置培養(yǎng)48 h以進(jìn)行活化；再用接種環(huán)將活化好的菌株接種到50 mL 營(yíng)養(yǎng)酵母葡萄糖液體（nutrient yeast dextrose broth,NYDB）培養(yǎng)基中，置于250 mL錐形瓶?jī)?nèi)，于28 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h；隨后吸取1 mL上述菌液分別加入到50 mL NYDB培養(yǎng)基和50 mL 12%NaCl-NYDB培養(yǎng)基（牛肉浸膏8 g，酵母浸膏5 g，葡萄糖10 g，氯化鈉120 g，用水定容至1 000 mL，于121 ℃條件下高壓蒸汽滅菌20 min）中，再于28 ℃、200 r/min條件下傳代培養(yǎng)24 h。收集一定體積的上述2 種培養(yǎng)液，在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min，對(duì)離心收集所得菌體用無菌水洗滌2次，棄上清液，轉(zhuǎn)移至凍存管中，立即放入液氮進(jìn)行速凍，并且于－80 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3750 全自動(dòng)滅菌鍋（日本Sanyo 公司）；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；SIGMA 3K-15 離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；QYC-211全溫空氣搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LRH-250 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）；光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PTC-225熱循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；一步法實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)ABI公司）；Oligo（dT）磁珠試劑盒（武漢哇哇噻納技術(shù)開發(fā)有限公司）；PrimeScriptTM單鏈cDNA 合成反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、PrimeScriptTM雙鏈cDNA 合成試劑盒、RNAiso Plus 動(dòng)物/植物/微生物/培養(yǎng)細(xì)胞總RNA 提取試劑盒、PrimeScriptTM除去基因組DNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTM嵌合Ex TaqTM熒光定量PCR 試劑盒，均由日本TaKaRa公司提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA 的提取與文庫(kù)的構(gòu)建

采用Invitrogen Trizol 試劑（美國(guó)Thermo Fisher科技公司）[11]提取2 種培養(yǎng)條件（鹽脅迫和非鹽脅迫）下M. guilliermondii 的總RNA，利用Nanodrop（美國(guó)Thermo Fisher 科技公司）檢測(cè)RNA 純度，然后利用Qubit 2.0 對(duì)RNA 濃度進(jìn)行精確定量，使用Aglient 2100 檢測(cè)RNA 樣品的完整性。樣品檢測(cè)合格后，首先用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物的mRNA，隨后加入緩沖碎片將mRNA打斷成短片段，以mRNA 為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成第1鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs 和DNA 聚合酶Ⅰ和RNaseⅡ合成第2 鏈cDNA，再用AMPure XP磁珠純化雙鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA 先進(jìn)行末端修復(fù)、加A 尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP磁珠進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到最終的DNA擴(kuò)增文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，分別使用Qubit 2.0和Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的濃度和插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，使用定量PCR（quantitative PCR,qPCR）對(duì)文庫(kù)濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量（文庫(kù)有效濃度＞2 nmol/L），以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.3.2 測(cè)序及數(shù)據(jù)過濾

庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)上機(jī)數(shù)據(jù)量的需求合并后進(jìn)行Illumina HiSeqTM高通量測(cè)序，得到原始測(cè)序序列（raw reads）。本試驗(yàn)所有測(cè)序工作在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。為了保證信息分析質(zhì)量，數(shù)據(jù)分析之前需先對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行過濾：1）去除帶接頭的測(cè)序序列；2）去除未知堿基N 比例大于10%的測(cè)序序列；3）去除過大過小等低質(zhì)量的測(cè)序序列，以得到高質(zhì)量序列（clean reads）。

1.3.3 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

本試驗(yàn)研究的M.guilliermondii為非模式生物，目前無相關(guān)全基因組測(cè)定結(jié)果。對(duì)于無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析，采用Trinity 法[12]將測(cè)序所得的高質(zhì)量序列拼接成轉(zhuǎn)錄本（mRNA 序列），用Corset 程序?qū)D(zhuǎn)錄本進(jìn)行層次聚類，以聚類后的序列為參考，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋、基因表達(dá)水平分析、差異基因功能注釋和富集分析等。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（real time quantitative reverse polymerase chain reaction, RT-qPCR）對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的驗(yàn)證

cDNA 模板合成步驟參照去基因組DNA PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒［RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）］說明書，用無菌水對(duì)反轉(zhuǎn)錄樣品進(jìn)行梯度（2、4、6、8、10倍）稀釋，并以稀釋后的cDNA 為模板進(jìn)行qPCR 反應(yīng)（每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)重復(fù)），選取CT值在15～25 間的cDNA 的合適稀釋倍數(shù)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2 次及以上，直至2次試驗(yàn)結(jié)果一致，RT-qPCR試驗(yàn)詳細(xì)步驟參照TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒說明書。兩步法PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件如下：95 ℃變性15 s，以0.3 ℃為步階從60 ℃升溫至95 ℃，95 ℃保溫15 s。利用一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Thermo Fisher 科技公司）檢測(cè)反應(yīng)體系熒光變化，相對(duì)定量計(jì)算采用2－△△CT方法[13]。目的基因的引物設(shè)計(jì)和合成均由生工生物工程（上海）有限公司完成，引物序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of target genes by RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和質(zhì)控報(bào)告

采用Illumina HiSeqTM高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）條件下培養(yǎng)24 h的M.guilliermondii進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果如表2 所示。經(jīng)測(cè)序質(zhì)量控制，共獲得55.39 Gb 高質(zhì)量堿基，各樣品堿基錯(cuò)誤率接近于0，Q20 和Q30 堿基百分比均不小于93%，樣品各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)達(dá)到質(zhì)量要求，適合之后的深度分析。

2.2 季也蒙畢赤酵母響應(yīng)鹽脅迫的基因差異表達(dá)分析

為了探究M. guilliermondii 在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）培養(yǎng)條件下的差異表達(dá)基因，對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選條件為：校正后的P值＜0.05且|log2（差異倍數(shù)）|＞1。結(jié)果如圖1所示：鹽脅迫組與非鹽脅迫組之間有1 027個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中458個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，569個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

表2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of data output quality

圖1 試驗(yàn)組差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plot of the differential expression genes among test groups

2.3 差異表達(dá)基因的GO 功能注釋和富集分析

GO富集分析能夠了解差異表達(dá)基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)，共涵蓋基因的分子功能（molecular function）、所在的細(xì)胞組分（cellular component）和參與的生物過程（biological process）等3 方面的內(nèi)容。本研究將M. guilliermondii 在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）培養(yǎng)條件下篩選得到的差異基因采用GOseq方法[14]進(jìn)行GO富集分析，并挑選富集最顯著的30 個(gè)GO 項(xiàng)繪制差異基因GO富集柱狀圖，結(jié)果如圖2所示：經(jīng)鹽脅迫后M.guilliermondii的差異表達(dá)基因主要富集在生物過程分類中，其中，代謝過程類別所占比例最大，其次為生物合成過程類別及單組織過程類別；在細(xì)胞組分分類中，細(xì)胞核部分所占比例最大；在分子功能分類中，離子結(jié)合及催化活性功能類別占比最大。由此可以得出，由于鹽脅迫培養(yǎng)，導(dǎo)致M.guilliermondii的核組裝、核苷酸代謝、糖代謝及輔酶代謝基因產(chǎn)生了較大差異，進(jìn)而影響了細(xì)胞的分裂及代謝過程。

2.4 差異基因KEGG 富集分析

圖2 差異表達(dá)基因GO富集柱狀圖Fig.2 GO enrichment histogram of differential expression genes

KEGG 是有關(guān)基因通路的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。在生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，通過通路（pathway）顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本試驗(yàn)差異基因的通路富集分析結(jié)果表明：差異表達(dá)基因分布在90個(gè)通路中，其中將富集最顯著的20條通路繪制差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖，并通過富集因子、Q 值和富集到此通路上的基因個(gè)數(shù)來衡量富集程度，結(jié)果如圖3 所示。季也蒙畢赤酵母在鹽脅迫（12% NaCl）與非鹽脅迫（0% NaCl）培養(yǎng)條件下，KEGG代謝通路中顯著富集的有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，DNA復(fù)制，脂肪酸生物合成，減數(shù)分裂-酵母調(diào)控，半乳糖代謝，過氧化物酶體，甲烷代謝，氨基糖和核苷酸糖代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，MAPK信號(hào)通路-酵母，苯丙氨酸代謝，氰基氨基酸代謝，細(xì)胞周期-酵母等信號(hào)通路。其中大部分富集通路都與細(xì)胞的分裂、代謝有關(guān)，且也有文獻(xiàn)證明MAPK 信號(hào)通路與生物受到逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[16-17]。

2.5 差異表達(dá)基因的RT-qPCR 驗(yàn)證

本試驗(yàn)隨機(jī)選取12個(gè)分別在MAPK信號(hào)通路-酵母中顯著變化的基因（STE12、RHOA、PBS2、GPD1、GRE2、FKS2、HOG1、BMH1, 2-YWHAE、SHO1、STE20-PAK1、WSC2、CSNKI）進(jìn)行RT-qPCR分析以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性，以Actin作為內(nèi)參基因，驗(yàn)證結(jié)果如圖4 所示。經(jīng)過鹽脅迫培養(yǎng)后，M.guilliermondii上述12個(gè)基因中有7個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，5 個(gè)基因表達(dá)顯著下調(diào)。RT-qPCR 定量分析顯示，RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中差異表達(dá)基因的變化趨勢(shì)一致，說明此次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可信度很高。

3 討論與結(jié)論

本研究將M. guilliermondii 在鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并通過Illumina HiSeqTM高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)定。結(jié)果表明：鹽脅迫（12%NaCl）與非鹽脅迫（0%NaCl）下培養(yǎng)的M.guilliermondii 相比共有1 027 個(gè)顯著性差異表達(dá)基因，其中458 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，569個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過GO富集發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鹽脅迫處理后M.guilliermondii 的差異表達(dá)基因主要富集在生物過程分類中，其中核苷酸代謝、糖代謝及輔酶代謝基因產(chǎn)生較大差異。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果大部分富集通路都與細(xì)胞的分裂、代謝有關(guān)，與GO 富集結(jié)果相對(duì)應(yīng)。推測(cè)可能是因?yàn)辂}脅迫促進(jìn)了M.guilliermondii的生物代謝過程，提升了自身的復(fù)制與代謝效率，從而增強(qiáng)了M.guilliermondii 的抗逆性。MAPK 信號(hào)通路-酵母與酵母受到逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[18-20]，對(duì)隨機(jī)選取的MAPK 信號(hào)通路-酵母的12 個(gè)顯著上/下調(diào)表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，其結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果趨于一致。以上轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以為鹽脅迫培養(yǎng)對(duì)M.guilliermondii 的生長(zhǎng)影響及進(jìn)一步的生物學(xué)探究提供科學(xué)依據(jù)。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集散點(diǎn)圖Fig.3 Enrichment scatter plot of differential expression genes’ KEGG pathway

圖4 基于實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）的季也蒙畢赤酵母基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析Fig.4 Transcriptional expression analysis of differential expression genes on M. guilliermondii detected by real-time quantitative reverse polymerase chain reaction(RT-qPCR)