熊 潔 諶禮佩 江青松

膠原纖維的穩(wěn)定性對于脫礦牙本質(zhì)表面的粘接界面完整性具有巨大影響，尤其在多年行使功能后尤為重要[1]。粘接劑層下暴露的牙本質(zhì)膠原纖維易于受到細菌和宿主源性的金屬基質(zhì)蛋白酶的攻擊，成為粘接持久性的薄弱環(huán)節(jié)[2,3]。近年來，研究者對于提高粘接界面穩(wěn)定性進行了多種方法的嘗試，交聯(lián)劑的使用被證明具有明顯積極影響[4-7]。它可以通過分子內(nèi)和分子間的聯(lián)結(jié)提高膠原纖維的機械和生物穩(wěn)定性，從而穩(wěn)定粘接界面。戊二醛是一種最有效并廣泛使用的交聯(lián)劑，但是，其殘余物具有很高毒性，無法用于人體[8,9]。碳二亞胺（EDC）作為一種無毒的交聯(lián)劑也出現(xiàn)在許多研究中，但其作用較弱[10,11]。交聯(lián)技術(shù)可以用于將天然生物聚合物整合至膠原纖維中以提高機械性能[12-14]，殼聚糖就是其中之一[15,16]。殼聚糖是一種具有多種性能的親水性聚合物,其大量的羥基與氨基基團可以與膠原及膠原酶形成化學(xué)結(jié)合,直接阻止膠原纖維上與酶的結(jié)合位點或是直接抑制膠原酶的活性,從而直接提高纖維的抗降解性能[17];同時,它也可以粘接至具有負電荷的細菌細胞,改變了細胞膜的通透性直至死亡,因此具有抗菌性能[18,19]。已有研究證實Csnp處理的交聯(lián)牙本質(zhì)膠原纖維展現(xiàn)出更好的機械屬性和更高的抗酶解性[13]。根管內(nèi)纖維樁的粘接界面在長期使用后容易出現(xiàn)纖維降解,形成細菌的侵入通道,更進一步加劇粘接界面完整性的破壞。因此,本研究旨在觀察根管牙本質(zhì)在Csnp和EDC的作用下對纖維樁在根管內(nèi)的粘接質(zhì)量的影響。

1.材料與方法

1.1 牙體收集 收集38顆單根管離體人牙,納入標(biāo)準(zhǔn)為無齲壞、無裂紋的上頜前牙及單根管的前磨牙,消毒后置于4 ℃氯化鈉溶液中,三個月內(nèi)使用。

1.2 根管預(yù)備和樁道預(yù)備 在釉牙骨質(zhì)界處去除牙冠部,清理通暢根管,10#K（馬尼,Tichigi,日本）鉆確認工作長度,鎳鈦Protaper（登士柏,瑞士）預(yù)備根管至F3后用Macro-lock標(biāo)準(zhǔn)鉆（RTD,法國）預(yù)備樁道至#4,每次更換鉆時以1%NaCIO和17%EDTA交替沖洗,最后大量生理鹽水沖洗待用。

1.3 試劑制備 所有化學(xué)試劑均購于Sigma公司。Csnp是基于前期研究文獻合成[20],溶于去離子水中,形成1 mg/ml溶液。細菌酶（P/N C-0130）溶于含0.36mM CaCl2的50mM HEPES 緩沖液中,形成0.1 mg/ml酶溶液。33mM交聯(lián)劑EDC、8mM NHS以及50mM的MES緩沖液溶于40%的乙醇中,形成EDC交聯(lián)劑溶液。

1.4 試件處理 所有牙根以32%磷酸（UNIETCH,Bisco,美國）酸蝕15s,沖洗20s,吹干,隨機選取2顆牙根,分別進行Csnp預(yù)處理：A：將牙根靜置于Csnp溶液中1 min后輕輕沖洗;B：將牙根置于Csnp溶液中超聲作用1 min后輕輕沖洗,隨后均經(jīng)EDC交聯(lián)劑作用24h,然后沖洗10s。抽真空干燥后,噴金,進行電鏡觀察。其余牙根進行粘接試件處理：根據(jù)粘接劑處理方式不同36顆牙分為三組（n=12）：A：浸泡在戊二醛溶液中24h;B在Csnp溶液中超聲作用1 min,輕輕沖洗,浸泡至EDC中24h,沖洗;C：無預(yù)處理（對照組）。分組處理完成后,使用商品粘接劑All-Bond 3A、B液均勻混合,小毛刷涂粘接劑20s,氣槍輕吹15s后光照固化,之后使用Duo-link（Bisco,Schaumburg,美國）進行根管內(nèi)纖維樁（Macro-lock,RTD,法國）粘接。所有粘接操作由同一人完成。固化后,所有樣本置于去離子水中24h后進行粘接質(zhì)量的評價。

1.5 粘接質(zhì)量的評價

1.5.1 粘接界面電鏡觀察 每組取一個牙根橫向切割1 mm厚牙片4片進行界面觀察。所有試件進行酸蝕、沖洗、然后置于5%次氯酸鈉溶液10 min,沖洗20s。梯度酒精脫水后吹干,進行SEM評估。

1.5.2 原位聚合轉(zhuǎn)化率（DC）每組取2個牙根,每個牙根水平向切割出4片1.0 mm左右厚度的薄片進行粘接劑聚合轉(zhuǎn)化率的評價。將切片依次在600,800, 1500目砂紙上進行打磨后,使用5.25%次氯酸鈉擦拭,超聲清潔10 min,然后保存24h后置于拉曼光譜顯微鏡（LabRAM HR Evolution, Horiba Scientific, 日本)。校對系數(shù)后,每個樣品取4個標(biāo)準(zhǔn)位點在1.5mW,波長532 nm的半導(dǎo)體激光下進行分析。空間分辨率0.1 μm,積累時間60s,放大倍數(shù)50倍。每個試件取900 cm-1and 2400 cm-1范圍內(nèi)圖譜,以O(shè)rigin Pro 2018進行相關(guān)分析。將未固化的粘接劑置于玻璃板上進行光譜分析作為基數(shù)。雙鍵的聚合轉(zhuǎn)化率根據(jù)下列公式進行計算：DC (%)=(1-［R 固化后/R 未固化］)×100%,R指脂肪族和芳香族在1637 cm-1處和1608 cm-1處波峰強度。

1.5.3 粘接強度 剩余27個牙根在根管上、下兩個部位以慢速切割機橫向截取1 mm左右厚度的牙片進行粘接強度評價。每個水平各2片,分別進行以下兩種處理：a. 即刻組：即刻測試粘接強度;b. 水解組：放置于0.1 mg/ml的膠原酶中72h后測試粘接強度。千分尺精確測量每個牙片的厚度和根管內(nèi)徑至0.01 mm。粘接面積由以下公式計算：A=π(R+r)√(R-r)2+h2。

π是常數(shù)3.14,R是上截面的內(nèi)半徑,r是下截面的內(nèi)半徑,h是試件的精確厚度。

將試件置于特制模具上通過萬能試驗機加載力（10 kg,1.0 mm/min）,計算各組粘接強度：P=N/A,

p是粘接強度MPa,N是脫粘接力N,A為粘接面積mm2

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計分析均采用SPSS20.0（a=0.05）,聚合轉(zhuǎn)化率、粘接強度使用方差分析和SNK-test進行統(tǒng)計分析。

2.結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)表面SEM觀察 不同方式Csnp預(yù)處理后根管牙本質(zhì)內(nèi)壁表面見圖1。可見靜置方式下Csnp納米顆粒僅有少量聚集成團的顆粒吸附在暴露的膠原纖維表面，大部分膠原纖維未見Csnp的吸附聯(lián)結(jié)（圖1-A）。超聲作用下，Csnp在根管內(nèi)壁表面分布較均勻，大部分暴露的膠原纖維網(wǎng)均可見納米顆粒的結(jié)合覆蓋，且較少出現(xiàn)團聚現(xiàn)象（圖1-B）。

圖1 .Csnp預(yù)處理后的根管內(nèi)壁

2.2 粘接界面電鏡觀察 電鏡觀察結(jié)果可見圖2。如圖所示：在各實驗組中均可觀察到典型的混合層與樹脂突，也有部分試件的混合層可觀察到不連續(xù)、厚度不均一，甚至部分缺如，牙本質(zhì)/粘接劑界面可觀察到在樹脂突及混合層下出現(xiàn)間隙。Csnp預(yù)處理組個別試件可觀察到樹脂突與混合層中Csnp納米顆粒，其余實驗組間未見明顯差異。

圖2 .粘接界面的電鏡觀察

2.3 粘接強度 各實驗組的粘接強度可見表1。各實驗組微推出粘接強度范圍從5.85-13.35Mpa。對照組在膠原降解后的粘接強度最低；Csnp預(yù)處理組的即刻粘接強度最高。就粘接方式而言，各組的即刻粘接強度沒有顯著差別（P=0.123），但膠原酶的降解使各實驗組的粘接強度均有降低（P=0.001），其中對照組以51.1%的比例降低最多。A組和B組的降低分別為29.2%和34.1%。

表1 .各實驗組微推出粘接強度（均數(shù)±SD)

2.4 聚合轉(zhuǎn)化率評價 統(tǒng)計結(jié)果顯示各組間的樹脂粘接劑的聚合轉(zhuǎn)化率沒有顯著差異（P=0.552），范圍為81.3%-83.3%。無論戊二醛還是Csnp、EDC的預(yù)處理，對于根管牙本質(zhì)的粘接劑的聚合固化，并沒有產(chǎn)生顯著影響。

表2 .各實驗組的粘接界面的樹脂聚合轉(zhuǎn)化率（均數(shù)±SD)

3.討論

本研究的結(jié)果顯示Csnp 與交聯(lián)劑EDC 對根管內(nèi)壁的作用可以提高粘接界面的膠原纖維對酶解的抵抗性，穩(wěn)定粘接強度，且對粘接劑的聚合轉(zhuǎn)化率無顯著影響。

前期研究中顯示：Csnp 與膠原纖維溶液的反應(yīng)是基于正負電荷的分子間相互吸引，形成一個典型聚合物[18]。但是，當(dāng)Csnp 溶液作用于脫礦牙本質(zhì)暴露的膠原纖維時，其相互之間的作用可能不完全相同。SEM（圖1）顯示Csnp 的作用方式對于其與脫礦牙本質(zhì)的膠原纖維的聯(lián)結(jié)具有影響。當(dāng)脫礦牙本質(zhì)在Csnp 溶液中靜置1 min 時電鏡顯示Csnp 納米粒子聚集成團，稀疏的散落在牙本質(zhì)表面；而超聲作用1 min 使得Csnp 明顯密度增多，顆粒變小，較均勻的分散在脫礦牙本質(zhì)表面暴露的膠原纖維上。超聲因素在根管內(nèi)已被廣泛應(yīng)用于清理、殺菌、傳輸?shù)雀鱾€方面，而對于Csnp 納米顆粒在根管內(nèi)壁的分布與結(jié)合的影響，其原因可能在于超聲能量產(chǎn)生的聲流和輻射壓力可能有助于阻止納米顆粒的聚集結(jié)團，并有助于顆粒對深層次的滲入，增加接觸頻率和時間，利于其在牙本質(zhì)表面更均一的分布。

Csnp 在牙本質(zhì)表面與膠原纖維的結(jié)合會給與纖維樁的粘接界面帶來以下方面影響。首先，前期的基礎(chǔ)研究表明，Csnp 可以與膠原纖維結(jié)合，并與膠原纖維酶反應(yīng)，降低纖維的降解[16]。在此基礎(chǔ)上，我們認為結(jié)合至牙本質(zhì)表面的Csnp 會降低粘接界面的纖維降解，穩(wěn)定粘接強度。粘接強度的實驗結(jié)果證明了這種想法。統(tǒng)計分析表明：交聯(lián)劑與Csnp的預(yù)處理對各試驗組的即刻粘接強度并無顯著影響，但膠原酶作用72h 后，各組之間產(chǎn)生顯著差異，對照組降低量最多，明顯高于兩個實驗組，說明交聯(lián)劑或Csnp 對粘接界面的纖維起了保護的作用，降低其降解量，提高了纖維對膠原酶的抵抗，從而在膠原酶的作用下，其粘接強度降低量較少。而另一方面，在涂布粘接劑之前，粘接界面結(jié)合的Csnp對粘接劑固化是否影響，對粘接界在膠原纖維網(wǎng)的滲透是否影響，是需要評價的方面。從實驗結(jié)果可以看出，各實驗組的聚合轉(zhuǎn)化率沒有統(tǒng)計學(xué)差異，反映Csnp 與交聯(lián)劑的預(yù)處理并沒有干擾到粘接層的固化，而粘接界面的SEM 照片顯示，各組均可觀察到樹脂滲透形成樹脂突，Csnp 組的部分試件可觀察到納米顆?；旌显谡辰咏缑婧蜆渲恢校ㄒ妶D2），其余未見明顯組間差異。此外，各實驗組的即刻粘接強度未見明顯差異，也從側(cè)面證明各實驗組的牙本質(zhì)粘接面預(yù)處理（戊二醛，Csnp/EDC）并未對粘接劑固化和樹脂在管壁牙本質(zhì)的滲透產(chǎn)生影響。