陳二方 邱陽 王人鳳 劉珍珍 石力 查定軍 邱建華

NELL2(Nel -like type 2 molecule)，又稱尼爾樣2型分子，是一種神經(jīng)元特異性分泌蛋白，主要在大腦的海馬和皮層的神經(jīng)元中表達，其主要功能是促進神經(jīng)元的存活和分化[1]。而在哈佛大學(xué)內(nèi)耳基因庫檢索發(fā)現(xiàn)NELL2在內(nèi)耳也有表達，本課題組前期實驗證實NELL2主要表達于耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞[2]。此外，課題組在一個常染色體顯性遺傳性非綜合征型聽神經(jīng)病譜系障礙(auditory neuropathy spectrum disorder，ANSD)家系中，通過全外顯子測序和基因連鎖分析，也發(fā)現(xiàn)了NELL2基因[3]，鑒定發(fā)現(xiàn)NELL2基因第45 097 607位堿基發(fā)生雜合突變，導(dǎo)致NELL2蛋白第457位氨基酸由半胱氨酸(Cys/C)突變?yōu)楸奖彼?Phe/F)。由此推測NELL2的C457F突變可能導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致NELL2保護神經(jīng)元的功能改變或喪失，最終誘導(dǎo)非綜合征型ANSD的發(fā)生。

為進一步探討NELL2在非綜合征型ANSD發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，本實驗通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[4]，初步嘗試構(gòu)建NELL2a基因敲除的斑馬魚模型，并比較NELL2a基因在AB野生型斑馬魚和基因敲除斑馬魚中的表型變化，為下一步闡明NELL2在聽覺形成中的作用及ANSD的遺傳學(xué)檢測等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 AB品系野生型斑馬魚來自西京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科全軍航空航天醫(yī)學(xué)內(nèi)耳研究重點實驗室，并在本實驗室傳代；斑馬魚在28.5 ℃恒溫環(huán)境中生長，光照時間：黑暗時間為14：10，胚胎用egg water培養(yǎng)，養(yǎng)殖方法按照《Zebrafish Book》(http://www.zfin.org)常規(guī)進行。

1.1.2質(zhì)粒 Cas9 mRNA表達質(zhì)粒pGH-T7-zCas9[5, 6]，用來構(gòu)建gRNA表達質(zhì)粒的骨架載體gRNA-pMD19-T[7]，購自武漢國家斑馬魚資源中心。

1.2實驗方法

1.2.1整胚原位雜交 RNA探針制備：斑馬魚成魚剪尾鰭，用RNA提取試劑盒(RNeasy Micro kit,Qiagen, Cat No./ID: 74004)提取總RNA，然后用QuantiTect Rev. Transcription Kit(Qiagen，Cat No./ID: 205310)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計引物，擴增目的片段，克隆到體外轉(zhuǎn)錄載體pGEM-T Easy Vector(promega，cat.no.A1360)上。通過體外轉(zhuǎn)錄獲得斑馬魚反義RNA探 針 ，用NucAwayTM Spin Column(invitrogen，AM10070)純化探針。收集斑馬魚胚胎，用4%多聚甲醛固定，雜交步驟參照文獻進行[8]。

1.2.2gRNA靶位點引物設(shè)計 在CRISPR/Cas9靶位點設(shè)計網(wǎng)站zifit(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)尋找符合以下要求的gRNA靶位點：①靶點位于翻譯起始密碼子ATG之后和基因編碼序列全長2/3之前的區(qū)域，不要選擇5-UTR和3-UTR區(qū)域；②最好能破壞重要的結(jié)構(gòu)域或所有的轉(zhuǎn)錄本；③如果基因含有多個外顯子，可能在第一個起始密碼子的下游還存在額外的具有相同閱讀框的起始密碼子，故最好不要在第一個外顯子上選擇靶點，同時也要避免在最后一個外顯子上選擇靶點；④如果基因含有多個轉(zhuǎn)錄本，最好在其共有外顯子區(qū)域選擇靶點；⑤靶點可設(shè)計在外顯子和內(nèi)含子的交界處，打靶破壞掉基因的剪接；⑥避免選擇含“TTTT”轉(zhuǎn)錄終止序列的靶點。

1.2.3gRNA模板合成 gRNA scaffold克隆到pMD 19-T vector (TakaRa; cat#D102A)(Amp-resistant)。gRNA 模板的合成通過PCR的方式獲得，設(shè)計引物如下Forward-Primer:TGTAATACGACTCACTATA-gGTCATGACTTCTGTG-GTTTTAGAGCT-AGAAATAGC，Reverse-Primer:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACT。PCR體系(50 μl)配制如下: 5×PCR buffer 10 μl，質(zhì)粒DNA (50 ng/μl) 1 μl，F(xiàn)orward Primer (10 μM) 2 μl，Reverse-Primer (10 μM) 2 μl，Taq DNA Polymerases 1 μl，dNTP 4 μl，H2O 30 μl。PCR程序設(shè)置如下：①98 ℃ 5 mins；②98 ℃ 10，65 ℃ 15，68 ℃ 1 min，35 cycles；③72 ℃ 7 mins；④4 ℃ ∞；使用Fermentas GeneJETTMPCR Purification Kit對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.2.4體外轉(zhuǎn)錄合成gRNA和Cas9 mRNA ①制備gRNA: 用T7 RNA Polymerase (NEB; cat#M0251S)體外合成 gRNA；體外轉(zhuǎn)錄體系(20 μl)配制：2.5 mM NTP 4 μl，10× Reaction Buffer 2 μl，gRNA template 0.5～1 μg，T7 RNA Pol 2 μl，Nuclease-free water補足20 μl；37 ℃水浴孵育一個小時以上；用SigmaSpinTMSequencing Reaction Clean-Up(S5059-70EA)，對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化。②制備Cas9 mRNA：首先用XbaI (NEB; cat#R0145T)，對pGH-T7-zCas9質(zhì)粒進行線性化，酶切體系如下：DNA (10 μg)，10×cutsmart，10 μl， XbaI 40 U, H2O補足100 μl；37 ℃，水浴放置3～5 h；然后用Fermentas GeneJETTMPCR Purification Kit，對酶切產(chǎn)物進行回收；體外轉(zhuǎn)錄體系(20 μl)配制：2×NTP/CAP 10 μl，10×Reaction Buffer 2 μl，linear template DNA 0.5～1 μg，Enzyme Mix 2 μl，Nuclease-free water補足20 μl；37 ℃水浴2～2.5 h；然后使用Ambion mMESSAGE mMACHINE kit，純化Cas 9 mRNA純化。

1.2.5顯微注射制備F0代斑馬魚 將gRNA、Cas9mRNA按照合適的濃度和10%酚紅混勻后，共同注射到單細胞期的野生型斑馬魚胚胎卵黃囊中。每顆受精卵注射量為1～2 nl，留取適量同批未注射的胚胎作為對照。

1.2.6檢測gRNA效果 待胚胎發(fā)育至24 h后，分別收集對照組和顯微注射組胚胎各20枚，用FOREGENE Zebra Fish Direct PCR Kit(Cat.No.TP-01412)提取基因組，設(shè)計引物如下Forward-Primer:5′-AGTGAAGTTTCTCCTCCTGACG-3′Reverse-Primer: 5′-CTCAACTTTGATCATCAGCTGTG-3′。PCR，擴增靶序列，送測序(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)確認突變。如果測序峰圖顯示在靶位點附近，對照組為干凈的單一峰，而顯微注射組出現(xiàn)雙峰或套峰，則能確定該gRNA有效，可以造成斑馬魚NELL2a基因突變。

1.2.7篩選有可遺傳突變的NELL2a F0代斑馬魚 F0代斑馬魚飼養(yǎng)至性成熟后(約3個月)即可進行陽性個體的篩選和傳代，取10～15條成魚與野生型成魚側(cè)交，注意此處需一對一交配，分別收集胚胎，單獨培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至24 hpf后，即可每組隨機挑選10枚胚胎，低溫用研磨棒研磨，用Foregene(Zebra Fish Direct PCR Kit)提取基因組DNA，作為模板，經(jīng)PCR擴增后，送測序。如果在靶位點附近測序峰圖出現(xiàn)雙峰或套峰，說明該條魚的突變發(fā)生在原始生殖細胞，可遺傳到F1代。如果靶位點附近的測序峰圖為干凈的單一峰，說明突變發(fā)生在體細胞，不能遺傳到F1代，則把該條魚淘汰。選取有可遺傳突變的F0代成魚與野生型斑馬魚側(cè)交，收集胚胎，標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)，用于篩選攜帶可遺傳突變的F1斑馬魚。

1.2.8獲得攜帶可穩(wěn)定遺傳的NELL2a雜合突變斑馬魚品系 將獲得的F1代斑馬魚飼養(yǎng)到1～2月齡，對每條魚分別剪尾鰭后，提取基因組DNA，作為模板，利用鑒定引物PCR擴增后，送測序。剪尾鰭后的每條魚獨立養(yǎng)殖；如果在靶位點附近出現(xiàn)雙峰，說明該條魚為NELL2a雜合突變。隨后可以將雜合突變的PCR產(chǎn)物，做TA克隆，確定每條魚的具體突變類型。選取可造成NELL2a基因移碼突變的F1代雜合(NELL2a+/-)成魚，與野生型斑馬魚側(cè)交，后代經(jīng)過剪尾鰭，測序篩選，獲得批量可穩(wěn)定遺傳的F2代NELL2a+/-斑馬魚。待F2代NELL2a+/-斑馬魚性成熟后，將雌魚與雄魚自交，獲得NELL2a純合突變斑馬魚(NELL2a-/-)。

1.2.9NELL2a-/-斑馬魚的聽覺誘發(fā)電位(AEP)檢測 采用斑馬魚AEP檢測水箱，應(yīng)用美國TDT公司RZ6儀器檢測和記錄15條4月齡斑馬魚的AEP，將斑馬魚分為2組：野生型(WT)斑馬魚，6條； NELL2a-/-斑馬魚9條。因為斑馬魚聽力最佳范圍在600～1 000 Hz[9]，本實驗檢測頻率為600、800、1 000和2 000 Hz。

2 結(jié)果

2.1NELL2a基因在斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘表達 探針設(shè)計如下：NELL2a-ISH-up:CTTCAGTGCGAACGGAGAGT，NELL2a-ISH-down：CCGTGTTCGTCTATGCAGGT。原位雜交結(jié)果示NELL2a基因在斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘有表達(圖1)。

圖1 整胚原位雜交技術(shù)顯示NELL2a在側(cè)線神經(jīng)丘表達 圖中紅色箭頭所示

2.2gRNA靶位點選擇 根據(jù)gRNA設(shè)計要求，從候選序列中選擇第12Exon設(shè)計了gRNA的靶點，序列為5′-gGTCATGACTTCTGTG-3′。gRNA突變鑒定引物，F(xiàn)orward-Primer:(Nell2a-PF2)5′-AGTGAAGTTTCTCCTCCTGACG-3′，Reverse-Primer:(Nell2a-PR2)5′-CTCAACTTTGATCATCAGCTGTG-3′，產(chǎn)物長度為473 bp，可通過PCR產(chǎn)物，送測序，檢測斑馬魚突變。

2.3gRNA效果檢測 分別收集F0代斑馬魚及對照組斑馬魚胚胎，提取基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后，送測序發(fā)現(xiàn)gRNA有效(圖2)；同時收集足夠數(shù)量的胚胎，飼養(yǎng)用于篩選有可遺傳突變的F0代斑馬魚。

圖2 根據(jù)靶基因設(shè)計的gRNA設(shè)計有效

2.4獲得穩(wěn)定遺傳的NELL2a+/-斑馬魚 F1代斑馬魚經(jīng)TA克隆，篩選出三種可遺傳的NELL2a基因突變類型，分別為基因組缺失4個堿基(Δ4)的一種和2種基因組缺失2個堿基(Δ2)的NELL2a+/-突變(圖3)。Δ4缺失4個堿基，導(dǎo)致后面的閱讀框移碼，并使得第17號外顯子上編碼纈氨酸的密碼子突變成終止密碼子，造成整個蛋白質(zhì)翻譯提前終止，原有蛋白功能喪失，從而實現(xiàn)基因敲除的目的(圖3a)。Δ2缺失2個堿基，導(dǎo)致后面的閱讀框移碼，并使得第18號外顯子上編碼異亮氨酸的密碼子突變成終止密碼子，造成整個蛋白質(zhì)翻譯提前終止，原有蛋白功能喪失，從而實現(xiàn)基因敲除的目的(圖3b、3c)。

圖3 通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得3種基因突變雜合子 a. ΔTGCG4堿基缺失雜合子; b. ΔGC 2堿基缺失雜合子; c. ΔCG2堿基缺失雜合子

2.5獲得穩(wěn)定遺傳的NELL2a-/-斑馬魚 將獲得的NELL2a+/-(ΔGC)的斑馬魚自交，胚胎養(yǎng)至≥2月，剪尾鰭，提取基因組DNA，送測序，獲得NELL2a-/-純合突變斑馬魚(圖4)。NELL2a-/-成魚與野生型斑馬魚側(cè)交得到的NELL2a+/-(ΔGC)、NELL2a-/-成魚自交獲得NELL2a-/-(ΔGC)表型均和野生型無異(圖5)。

圖4 剪尾鰭測序 提示獲得NELL2a-/-純合突變斑馬魚

圖5 2dpf斑馬魚內(nèi)耳發(fā)育 a. AB品系; b. NELL2a+/-(ΔGC); c. NELL2a-/-(ΔGC)

將獲得的NELL2a+/-(ΔTGCG)的斑馬魚自交，胚胎在24 hpf內(nèi)和野生型表型無明顯差異，24 hpf后后代出現(xiàn)畸形，包括體軸彎曲、心肌包水及耳石異常(圖6、7)，胚胎發(fā)育至3 dpf開始死亡，7 dpf幾乎完全死亡，因此無法獲得NELL2a-/-(ΔTGCG)純合子。

圖6 野生型及NELL2a+/-(ΔTGCG)斑馬魚的發(fā)育過程 左圖示野生型斑馬魚發(fā)育過程;右圖示NELL2a+/-(ΔTGCG)斑馬魚發(fā)育,可見從48 hpf開始出現(xiàn)畸形

圖7 NELL2a+/-(ΔTGCG)斑馬魚胚胎畸形 a.尾巴嚴(yán)重畸形,心肌嚴(yán)重包水,2個耳石; b.心肌包水,3個耳石; c.心肌正常,2個耳石; d.心肌輕度包水,3個耳石; e.心肌嚴(yán)重包水,3個耳石; f.心肌嚴(yán)重包水,1個耳石(圖中紅色箭頭示心肌異常部位,藍色箭頭示耳石異常部位)

2.6斑馬魚的AEP檢測結(jié)果 NELL2a-/-斑馬魚在600、800、1 000和2 000 Hz聲刺激頻率，其AEP的閾值均顯著高于野生型斑馬魚(表1)。

表1 不同品系斑馬魚各頻率AEP閾值

3 討論

聽神經(jīng)病的病因很廣泛，致病機理尚不明確，可以有先天或后天的原因，可能包括早產(chǎn)、高膽紅素血癥、缺氧、先天性腦異常、耳毒性藥物暴露和遺傳因素等[10]，亟待建立動物模型，進行進一步研究。有研究對ANSD家系患者進行測序分析發(fā)現(xiàn)NELL2基因的45 097 607位堿基發(fā)生雜合突變，同時基因庫的數(shù)據(jù)也顯示內(nèi)耳存在NELL的表達。NELL2是一種特異性的分泌型的糖蛋白，由神經(jīng)元分泌，在神經(jīng)元的分化中起到重要作用；已有的研究證實NELL2在谷氨酸神經(jīng)元上表達較多，谷氨酸神經(jīng)元通過谷氨酸受體發(fā)揮作用，這種調(diào)節(jié)機制也存在于聽覺系統(tǒng)中[11]。對小鼠的研究發(fā)現(xiàn)NELL2在耳蝸結(jié)構(gòu)成熟與發(fā)育過程中起到重要作用，隨著發(fā)育的進行，Corti器上的NELL2蛋白逐漸積累[12]。上述研究結(jié)果表明NELL2在內(nèi)耳及聽力發(fā)育過程及生理功能中起重要作用，因此建立NELL2a的基因突變模型對研究其在聽力發(fā)育及障礙中的作用至關(guān)重要。

斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)(lateral line system，LL)是由皮膚衍生的機械感受器官，具有感覺周圍環(huán)境中的水流、強度以及方向等功能，便于探測到身體不同區(qū)域水流的差異[13]。側(cè)線系統(tǒng)以神經(jīng)丘為基本單位，分為前部側(cè)線系統(tǒng)和后部側(cè)線系統(tǒng)，成熟的神經(jīng)丘包括位于中間的功能性毛細胞和周圍的支持細胞及mentle 細胞構(gòu)成[14, 15]，側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動物內(nèi)耳毛細胞幾乎相同，都是通過立體纖毛的偏轉(zhuǎn)來感知運動[16]，是研究毛細胞發(fā)育、凋亡及再生的重要模型。NELL2 mRNA在大鼠胚胎期主要表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，出生后主要表達在腦組織的神經(jīng)元內(nèi)，與粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相伴存在[17]，其功能可以參與神經(jīng)生長與分化，參與突觸的形成和囊泡釋放以及下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)的分泌[18]。

本研究通過整胚原位雜交技術(shù)，證明了NELL2基因在斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘有表達；通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，獲得了2種2 bp缺失(ΔGC、ΔCG)，1種4 bp缺失(ΔTGCG)，3種均導(dǎo)致基因移碼突變，使翻譯提前終止，蛋白喪失原有的功能。然而2 bp缺失斑馬魚仔魚內(nèi)耳發(fā)育正常，4 bp缺失斑馬魚則出現(xiàn)體軸彎曲、心肌包水及耳石異常等畸形，具體的機制有待進一步探討。