何福林，黃麗佳，游周敏，梁 珍，邵金華

(湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199)

蓬蒿(Chrysanthemumcoronarium)，菊科蓬蒿屬，為一年生或兩年生草本植物[1]。蓬蒿在我國(guó)已經(jīng)有900多年的栽培歷史，是南、北方人都比較喜愛(ài)食用的一種蔬菜[2]?，F(xiàn)代研究表明，蓬蒿具有抗腫瘤、止咳祛痰、植物化感作用、殺蟲(chóng)、護(hù)肝、抗氧化和殺菌等多種生物活性[3]。蓬蒿籽質(zhì)地堅(jiān)硬，多數(shù)情況下被當(dāng)作廢棄物丟棄，造成資源浪費(fèi)[4]。多酚在植物的果實(shí)、根、葉以及皮中大量存在，不但能清除自由基、抑制氧化酶活性以及螯合金屬離子來(lái)抑制油脂氧化[5]，還能間接提高人體內(nèi)源性抗氧化酶的抗氧化活性[6]。

氧化是食用油脂酸敗的主要原因之一，油脂氧化過(guò)程中氫過(guò)氧化物不穩(wěn)定，分解產(chǎn)生醛、酮、酸等物質(zhì)[7]，這些物質(zhì)既對(duì)油脂的風(fēng)味、色澤、質(zhì)量有影響，還會(huì)產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，參與各種疾病的代謝途徑，導(dǎo)致神經(jīng)性疾病、癌癥、人體老化及冠心病的發(fā)生[8]。防止油脂氧化最有效的方式就是添加抗氧化劑[9]。目前，廣泛使用人工合成抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等，但其存在安全隱患，過(guò)量使用會(huì)致畸、產(chǎn)生慢性病及癌變等[10]。天然抗氧化劑綠色環(huán)保，安全性高，受到人們青睞[11]。植物多酚屬于天然的抗氧化劑，既安全又能減緩油脂的氧化[12]。目前，國(guó)內(nèi)外從植物中提取多酚的研究報(bào)道很多，但關(guān)于蓬蒿籽多酚的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文采用響應(yīng)面法優(yōu)化蓬蒿籽多酚的提取工藝，采用Schaal烘箱法研究蓬蒿籽多酚對(duì)不同油脂的抗氧化能力，以期為蓬蒿籽多酚的開(kāi)發(fā)和利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

菜籽油、花生油，由永州市冷水灘區(qū)中良榨油廠現(xiàn)榨；豬油，實(shí)驗(yàn)室自制。蓬蒿籽，市售。碳酸鈉、硫酸亞鐵、乙酸鈉、冰醋酸、沒(méi)食子酸等均為分析純。BHA、BHT，南京百慕達(dá)生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

F-008S超聲波清洗機(jī)，深圳福洋科技集團(tuán)有限公司；Agilent Cary 60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；GL124-1SCN電子分析天平，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司；PTHW-500普通恒溫電熱套，南京科爾儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將蓬蒿籽放入40℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，用12倍石油醚浸泡24 h脫脂，抽濾后濾渣于50℃烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蓬蒿籽多酚的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g脫脂蓬蒿籽粉，在一定的溫度、料液比下用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取一定時(shí)間后，用四層紗布過(guò)濾，真空抽濾收集濾液，真空濃縮后60℃真空干燥得蓬蒿籽多酚。

1.2.3 蓬蒿籽多酚得率的測(cè)定

1.2.3.1 多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取沒(méi)食子酸70 mg，少量蒸餾水溶解后用容量瓶定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液[13]。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用50 mL容量瓶定容，配成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0 mL至10.0 mL比色管中，再向每個(gè)比色管中加入福林酚試劑1.5 mL，充分搖勻30 s后加入6.0 mL 10%Na2CO3溶液，搖勻，加蒸餾水定容，在30℃避光放置2 h進(jìn)行顯色反應(yīng),以不含沒(méi)食子酸的比色管作為空白，在760 nm(由3 mL顯色后的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和蓬蒿籽多酚樣品溶液在400～900 nm下掃描確定的最大吸收波長(zhǎng))處測(cè)吸光度。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.038x-0.005 1，R2=0.998 6。

精密量取1.0 mL蓬蒿籽提取液(1.2.2中真空抽濾后的濾液)于10 mL比色管中，向其中加入1.5 mL福林酚試劑，充分搖勻30 s后加入6.0 mL 10%Na2CO3溶液，搖勻，加蒸餾水定容，在30℃避光放置2 h進(jìn)行顯色反應(yīng)，以不加蓬蒿籽提取液的作為空白，在760 nm處測(cè)吸光度。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出提取液中多酚含量。

1.2.3.2 多酚得率的計(jì)算

式中：C為蓬蒿籽提取液中多酚含量，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為蓬蒿籽粉質(zhì)量，g。

1.2.4 蓬蒿籽多酚對(duì)油脂的抗氧化效果測(cè)定

1.2.4.1 蓬蒿籽多酚對(duì)不同油脂抗氧化效果的影響

取豬油、菜籽油、花生油各50 g，向其中添加0.02%的蓬蒿籽多酚，混勻，放入(60±2)℃的烘箱中，每隔8 h搖勻并交換它們?cè)诤嫦渲械奈恢?，?、2、4、6、8、10、12、14、16、18 d取樣測(cè)定過(guò)氧化值(POV)，每次測(cè)定重復(fù)3次。

1.2.4.2 蓬蒿籽多酚與其他抗氧化劑抗氧化活性比較

取等量的豬油樣品各50 g，分別添加0.02%的蓬蒿籽多酚、BHT、BHA、檸檬酸、抗壞血酸,混勻，同時(shí)以不加抗氧化劑的豬油為空白對(duì)照，然后按1.2.4.1操作，測(cè)定油樣在加速氧化條件下的過(guò)氧化值。

1.2.4.3 蓬蒿籽多酚與其他抗氧化劑的協(xié)同作用對(duì)豬油的抗氧化效果

取等量的豬油樣品各50 g，分別添加0.02%蓬蒿籽多酚與0.02%BHT、0.02%BHA、0.02%檸檬酸、0.02%抗壞血酸4種復(fù)配物，以及0.04%的蓬蒿籽多酚，混勻，同時(shí)以不加抗氧化劑的豬油為空白對(duì)照，再按1.2.4.1操作，測(cè)定油樣在加速氧化條件下的過(guò)氧化值。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

在料液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間55 min條件下，考察提取溫度對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著，P<0.05。下同。圖1 提取溫度對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，蓬蒿籽多酚得率逐漸增加，當(dāng)提取溫度為70℃時(shí)，蓬蒿籽多酚得率最高，繼續(xù)升高提取溫度，其得率降低。這是因?yàn)殡S著提取溫度的升高，多酚物質(zhì)運(yùn)動(dòng)加劇，在乙醇中擴(kuò)散速度越快，提取效果越好，但提取溫度過(guò)高會(huì)破壞蓬蒿籽中的活性成分，而且會(huì)增加雜質(zhì)溶出量，降低多酚溶出量，使蓬蒿籽多酚得率下降[14]。

2.1.2 料液比對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間55 min、提取溫度70℃條件下，考察料液比對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比在1∶25時(shí)，蓬蒿籽多酚得率達(dá)到最大，說(shuō)明料液比越高，可溶性物質(zhì)溶出越多，可以提高蓬蒿籽多酚得率[15]。當(dāng)料液比超過(guò)1∶25 后，蓬蒿籽多酚得率變化不大且有下降趨勢(shì)，這是因?yàn)楫?dāng)料液比過(guò)高時(shí)，可溶性物質(zhì)溶出已達(dá)到最大，增加溶劑反而促進(jìn)其他雜質(zhì)溶出，增加了后續(xù)濃縮的難度[16]。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

在提取時(shí)間55 min、提取溫度70℃、料液比1∶25 條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～60%區(qū)間蓬蒿籽多酚得率呈上升趨勢(shì)，在60%～80%區(qū)間蓬蒿籽多酚得率呈下降趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，蓬蒿籽多酚得率最高，為14.83%?？赡艿脑蚴钱?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較小時(shí)，淀粉、蛋白質(zhì)、一些多糖以及果膠等部分親水性物質(zhì)會(huì)溶于乙醇溶液，影響多酚的提取[17]；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)會(huì)妨礙乙醇滲透進(jìn)植物細(xì)胞，從而影響多酚的提取[18]。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

在提取溫度70℃、料液比1∶25、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%條件下，考察提取時(shí)間對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)蓬蒿籽多酚得率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蓬蒿籽多酚得率逐漸升高，在提取時(shí)間為65 min時(shí)，蓬蒿籽多酚得率最高，超過(guò)65 min時(shí)，蓬蒿籽多酚得率降低?？赡苁且?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蓬蒿籽中的多酚會(huì)逐漸擴(kuò)散到溶劑中，當(dāng)達(dá)到一定的提取時(shí)間之后，蓬蒿籽多酚的溶解速度變慢，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加雜質(zhì)溶出，多酚結(jié)構(gòu)可能遭到破壞，從而導(dǎo)致得率下降。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box-Benhnken 中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分別考察提取溫度(X1)、料液比(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)及提取時(shí)間(X4)對(duì)蓬蒿籽多酚得率(Y)的影響。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析

2.2.3 最佳條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定蓬蒿籽多酚最佳的提取條件為：提取溫度74.55℃，料液比1∶27.16，乙醇體積分?jǐn)?shù)52.63%，提取時(shí)間69.65 min。在最佳條件下，蓬蒿籽多酚得率預(yù)測(cè)值為20.25%。結(jié)合實(shí)際綜合考慮，將理論值修正為提取溫度75℃、料液比1∶27、乙醇體積分?jǐn)?shù)53%、提取時(shí)間70 min,在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到蓬蒿籽多酚得率為20.36%。實(shí)際值接近理論值，說(shuō)明模型可靠。

2.3 蓬蒿籽多酚對(duì)油脂的抗氧化效果

2.3.1 蓬蒿籽多酚對(duì)不同油脂的抗氧化效果(見(jiàn)圖5)

由圖5可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同油樣的過(guò)氧化值不斷增大，未添加蓬蒿籽多酚的空白油樣的過(guò)氧化值迅速增加，而添加蓬蒿籽多酚油樣的過(guò)氧化值增速減緩。說(shuō)明蓬蒿籽多酚對(duì)豬油、菜籽油及花生油的氧化酸敗有不同程度的延緩作用。

圖5 蓬蒿籽多酚對(duì)不同油脂的抗氧化效果

2.3.2 蓬蒿籽多酚與其他抗氧化劑抗氧化活性比較(見(jiàn)圖6)

圖6 蓬蒿籽多酚與其他抗氧化劑抗氧化活性比較

由圖6可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同油樣的過(guò)氧化值都有不同程度的增長(zhǎng)，但添加抗氧化劑的油樣的過(guò)氧化值都低于空白油樣，添加蓬蒿籽多酚的油樣的過(guò)氧化值低于添加BHA及檸檬酸的油樣，高于添加BHT及抗壞血酸的油樣。說(shuō)明蓬蒿籽多酚的抗氧化能力強(qiáng)于檸檬酸和BHA，與BHT接近，低于抗壞血酸。

2.3.3 蓬蒿籽多酚與其他抗氧化劑的協(xié)同作用對(duì)豬油抗氧化效果(見(jiàn)圖7)

圖7 蓬蒿籽多酚與其他抗氧化劑協(xié)同增效作用

由圖7可知：隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，空白油樣的過(guò)氧化值迅速增大，而添加了蓬蒿籽多酚的油樣過(guò)氧化值明顯低于空白油樣；各復(fù)配組對(duì)油樣的抗氧化效果強(qiáng)于單一蓬蒿籽多酚組，復(fù)配組對(duì)豬油的抗氧化效果由強(qiáng)到弱為蓬蒿籽多酚+抗壞血酸>蓬蒿籽多酚+檸檬酸>蓬蒿籽多酚+BHT>蓬蒿籽多酚+BHA。蓬蒿籽多酚與有機(jī)酸實(shí)驗(yàn)組抗氧化效果的提高，可能是由于有機(jī)酸能夠與油中一些金屬離子螯合成金屬鹽，使油脂的催化能力降低，進(jìn)而增加了蓬蒿籽多酚的抗氧化能力[19-20]。

3 結(jié) 論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)蓬蒿籽多酚提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳的提取工藝條件為：提取溫度75℃，料液比1∶27，乙醇體積分?jǐn)?shù)53%，提取時(shí)間70 min。在最佳條件下，蓬蒿籽多酚得率為20.36%。蓬蒿籽多酚對(duì)油脂的抗氧化研究表明，蓬蒿籽多酚對(duì)豬油、菜籽油及花生油都有較好的抗氧化效果，蓬蒿籽多酚較檸檬酸和BHA對(duì)豬油的抗氧化效果好，并且與抗壞血酸、檸檬酸、BHA及BHT有協(xié)同增效作用。