楊宏黎，竇義蓮，韓琳娜，肖志剛, 3，阮有志，韓 旭

(1.沈陽師范大學 糧食學院，沈陽 110034； 2.朝陽師范高等?？茖W校 生化工程系，遼寧 朝陽 122000；3.東北農業(yè)大學 食品學院， 哈爾濱 150038)

阿魏酸是廣泛存在于多種植物中的一種酚酸，其在中草藥原料如阿魏、當歸等植物的葉、莖、根中含量較高，同時在食品原料如米糠和麥麩中含量也較高[1- 3]。阿魏酸是一種天然的抗氧化劑，同時還具有清除自由基、保護細胞、抑制血栓素釋放、抗癌、抗菌消炎等功能。但由于阿魏酸在油相和水相體系中的溶解度都較低，很難滲透進入生物質細胞膜發(fā)揮其功能，因此阿魏酸衍生物的制備得到廣泛關注。

三丁酸甘油酯是一種無色油狀的短鏈脂肪酸，廣泛存在于藥物中，具有低黏度、低熔點、低熱量的功能特性。此外，在藥理學及營養(yǎng)學方面，三丁酸甘油酯已被證實具有修復小腸絨毛，抑制腸道有害菌的功效，并且對多種癌細胞如前列腺癌、乳腺癌等細胞增殖具有抑制作用[4-5]。

將阿魏酸分子結合至三丁酸甘油酯可有效改善其脂溶性和水溶性。由于阿魏酸為熱敏性物質，生物催化以其反應條件溫和、副產物少、可降低反應對底物的損害等優(yōu)點[6-9]，被廣泛應用于阿魏酸衍生物的制備。

本課題前期研究中以甲苯為反應介質合成阿魏酰丁酸酯，但甲苯具有毒性。被稱為“綠色溶劑”的離子液體，具有蒸氣壓低、熱穩(wěn)定性強、環(huán)境友好等優(yōu)點。離子液體作為環(huán)境友好溶劑替代傳統(tǒng)揮發(fā)性有機溶劑具有廣闊前景。因此，本實驗在前期研究基礎上，探究了在離子液體-甲苯溶劑體系中酶催化合成阿魏酰丁酸酯工藝，研究了各因素對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響，優(yōu)化了反應條件，以期為阿魏酰丁酸酯的工業(yè)化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿魏酸乙酯(EF，純度>99%)，購自蘇州常通化學有限公司；三丁酸甘油酯(TB,純度>95%)，購自阿拉丁試劑有限公司；3 ?分子篩，購自上海環(huán)球分子篩有限公司；固定化脂肪酶Novozym 435和Lipozyme TL IM，購自諾維信公司上海分公司；甲苯、丙酮、甲醇、冰醋酸、乙腈、乙醇，分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；[EMIM][TF2N]，[OMIM][PF6]，[HMIM][BF4]，[BMIM][PF6]，[BMIM][BF4]等離子液體均購自西格瑪(上海)貿易有限公司。

JD2000-2L型電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；氣浴搖床，順華儀器股份有限公司；SH23-2恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；LC1200高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；TKRE-1000A旋轉蒸發(fā)器，天津市天科玻璃儀器制造有限公司；JW-1042型低速離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿魏酰丁酸酯的制備

取2 mL甲苯，按一定溶劑配比滴加離子液體。將溶劑置于反應容器中形成穩(wěn)定的溶劑體系，加入反應的原料三丁酸甘油酯與阿魏酸乙酯，之后再加入一定量的脂肪酶催化反應的進行，在一定溫度下空氣浴振蕩反應一段時間。反應體系在加酶前用分子篩(50 mg/mL)除水48 h。反應后過濾除去脂肪酶和分子篩，剩余混合物通過柱層析(硅膠柱，層析液體為正己烷-甲醇)分離純化。脂肪酶催化阿魏酸乙酯與三丁酸甘油酯酯化反應原理見圖1。

圖1 脂肪酶催化阿魏酸乙酯與三丁酸甘油酯酯化反應原理

1.2.2 阿魏酰丁酸酯轉化率的測定

采用高效液相色譜法對阿魏酰丁酸酯轉化率進行測定。液相色譜條件：ZorbaxODS-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；UV/DAD檢測器；柱溫30℃；流動相由冰醋酸-水(體積比3∶100，A)和乙腈(B)組成，洗脫程序為0～10 min，B由10%升至70%，10～20 min，B維持在70%，20～20.5 min，B由70%降至10%；流速1 mL/min；檢測波長325 nm；進樣量10 μL。

阿魏酰丁酸酯轉化率=(1,(3)-阿魏酰丁酸甘油酯峰面積+1,(3)-阿魏酰雙丁酸甘油酯峰面積)/總峰面積×100%。

1.2.3 數據處理

采用SPSS18.0和Origin 8.5軟件進行數據處理和分析；P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。每組實驗重復進行3次，取平均值。實驗數據以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 溶劑體系對轉化率的影響

前期對有機溶劑的篩選中發(fā)現(xiàn)，甲苯既可以溶解阿魏酸乙酯又可以溶解三丁酸甘油酯而成為該反應的反應介質。但甲苯具有一定的毒性，將譽為“綠色溶劑”的離子液體引入化學反應，可有效降低反應的毒性。由此，對離子液體-甲苯溶劑體系進行了篩選，考察溶劑體系對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響，結果見表1。

表1 溶劑體系對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響

從表1可以看出，不同溶劑體系下的阿魏酰丁酸酯轉化率不同。由于離子液體具有一定的黏度，作為反應介質還需與甲苯同時使用，以減小黏度。在[HMIM][BF4]-甲苯、[BMIM][PF6]-甲苯和[BMIM][BF4]-甲苯3種體系中，沒有產物的生成?？赡苁怯捎谥久窷ovozym 435在以上離子液體中的存在狀態(tài)不同，不能發(fā)揮催化特性。在[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系中阿魏酰丁酸酯的轉化率最高，顯著高于單獨以甲苯為反應介質的。因此，選取[EMIM][TF2N]-甲苯為后續(xù)實驗的反應介質。

2.1.2 脂肪酶種類對轉化率的影響

生物催化劑脂肪酶應用越來越廣泛，選擇固定化脂肪酶Lipozyme TL IM和Novozym 435進行酯化反應，考察脂肪酶種類對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響，結果見圖2。

從圖2可以看出，兩種脂肪酶均能催化阿魏酰丁酸酯的生成，但是反應體系中兩種酶的催化活性不同。隨著反應時間的延長，脂肪酶Novozym 435催化的反應，在反應6 d時阿魏酰丁酸酯轉化率達到65.54%，明顯高于脂肪酶Lipozyme TL IM催化的反應。因此，選用Novozym 435進行后續(xù)研究。同時，在反應6 d后，阿魏酰丁酸酯轉化率不再有顯著提高，因此選取反應時間為6 d。

注：底物摩爾比5∶1，酶添加量50 mg/mL，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，溶劑配比1∶2，反應溫度50℃。圖2 脂肪酶種類對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響

2.1.3 溶劑配比對轉化率的影響

甲苯和離子液體的配比不同，對反應的影響也不同，因此考察了不同溶劑配比對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響，結果見圖3。

注：脂肪酶Novozym 435，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，底物摩爾比5∶1，酶添加量50 mg/mL，反應溫度50℃，反應時間6 d。圖3 溶劑配比對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響

從圖3可以看出，隨著溶劑配比由1∶3升至1∶1，阿魏酰丁酸酯轉化率由59.24%提高至71.24%，這可能是由于離子液體中的陰、陽離子可提高酶催化效率。但隨著離子液體[EMIM][TF2N]占比繼續(xù)增大，阿魏酰丁酸酯轉化率不再有顯著升高，這可能與離子液體的黏度有關，離子液體的添加量增加，反應體系的黏度增加，降低了酶催化效率。因此，選擇溶劑配比為1∶1。

2.1.4 底物摩爾比對轉化率的影響

考察了不同的底物摩爾比對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響，結果見圖4。

從圖4可以看出：隨著底物摩爾比從1∶1增加至3∶1，阿魏酰丁酸酯轉化率有很大的提高；但當底物摩爾比由3∶1升至6∶1時，阿魏酰丁酸酯轉化率變化較小，這可能是由于底物的量已趨于飽和。因此，從經濟成本角度考慮，選擇最佳底物摩爾比為3∶1。

注：脂肪酶Novozym 435，酶添加量50 mg/mL，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，溶劑配比1∶2，反應溫度50℃，反應時間6 d。圖4 底物摩爾比對阿魏酰丁酸酯轉化率的影響

2.2 正交實驗

在前期實驗的基礎上，在脂肪酶Novozym 435為催化劑、酶添加量50 mg/mL、[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，[EMIM][TF2N]與甲苯質量體積比1∶1條件下，以底物摩爾比、反應溫度、反應時間為因素，以阿魏酰丁酸酯轉化率為指標，進行三因素三水平正交實驗。正交實驗因素水平見表2，正交實驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗設計及結果

表4 方差分析

由表2和表3可知，各因素對阿魏酰丁酸酯轉化率影響大小依次為A>B>C，最佳工藝組合為A2B1C2，即底物摩爾比3∶1，反應溫度50℃，反應時間6 d。在最佳條件下進行驗證實驗，阿魏酰丁酸酯的轉化率為76.24%。

3 結 論

采用離子液體-甲苯溶劑體系酶法合成阿魏酰丁酸酯。通過單因素實驗及正交實驗得到阿魏酰丁酸酯的最佳合成工藝條件為：以脂肪酶Novozym 435為催化劑，酶添加量50 mg/mL，[EMIM][TF2N]-甲苯溶劑體系，[EMIM][TF2N]與甲苯質量體積比1∶1，反應溫度50℃，底物摩爾比3∶1，反應時間6 d。在最佳反應條件下，阿魏酰丁酸酯轉化率為76.24%。