唐 林 肖望重 劉 檢 龍紅萍 吳 笛 王宇紅

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院， 湖南長沙410007； 2.中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地， 湖南長沙410208）

夾竹桃科蘿芙木屬植物，全世界約135 個種和變種，其中研究較多的是蘿芙木Rauvolfia verticillata（Lour.） Baill.、云南蘿芙木Rauvolfia yunnanensisTsiang、催吐蘿芙木Rauvolfia vomitoriaAfzel.及印度蘿芙木Rauvolfia serpentine（L.）Benth.ex Kurz［1?2］。云南蘿芙木具有清風熱、降肝火、消腫解毒的功效，民間用于治療高血壓、眩暈、頭痛、感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、痧癥腹痛吐瀉、風癢疥癥、蛇傷等癥［3］。該藥主要分布于云南西南部地區(qū)，是我國重要的南藥，也是比較稀缺的藥用植物［4］。催吐蘿芙木原產(chǎn)于西非加納，1965 年從非洲引種至我國，以后開始在西雙版納及云南其他地區(qū)推廣種植，是蘿芙木屬藥材中的優(yōu)良品種［5］。

云南蘿芙木和催吐蘿芙木均富含吲哚類生物堿，在降血壓、抗心律不齊、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面具有重要作用［6?7］，蘿芙木屬藥材是降壓藥（如復方降壓片、降壓靈） 的重要天然來源。但目前關于蘿芙木屬藥物的質(zhì)量控制方面研究較少，主要以測定單一有效成分為主，缺乏整體性質(zhì)量評價方法［8］。云南蘿芙木與催吐蘿芙木，2 種藥材性狀、產(chǎn)地、化學成分均相似，但藥效毒理作用差別較大，因而亟需建立整體性評價方法加以比較和區(qū)分，以便指導合理用藥。本實驗采用HPLC 指紋圖譜與化學模式識別相結(jié)合的方法對云南蘿芙木與催吐蘿芙木化學成分進行比較分析，以期為其質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 材料

1260Ⅱ型高效液相色譜儀（二元泵，柱溫箱，DAD 檢測器）、1290UPLC?6540 accurate mass Q?TOF 色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（配置Mass Hunter 質(zhì)譜工作站）（美國Agilent 公司）；SK?7200HP 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）；Purelab Option Q15 超純水機（法國Elga 公司）。甲醇、乙醇、三乙胺均為分析純（上海國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈色譜純（德國Merck 公司），自制雙蒸水。利血平對照品（批號100041?201213，中國食品藥品檢定研究院）。

從云南各產(chǎn)地共收購和采集了15 批樣品（11批云南蘿芙木及4 批催吐蘿芙木），信息見表1。藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院張志國教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A） ?0.05% 三乙胺溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，75%B；10～15 min，75%～60% B；15～25 min，60% B；25～40 min，60%～30%B；40～50 min，30%～10%B）；體積流量1 mL／min；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。記錄時間50 min。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2.1.2 液質(zhì)條件 Agilent Extend C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相乙腈（A） ?0.1%甲酸胺（B），梯度洗脫（0～5 min，75%B；5～8 min，75%～60% B；8～13 min，60% B；13～20 min，60%～30%B；20～25 min，30%～10%B）；體積流量0.4 mL／min；進樣量2 μL。記錄時間25 min。電噴霧離子化 （ESI），準確質(zhì)量數(shù)用ESI?L Low Concentration Tuning Mix （G1969?85000）校正，正離子分析模式，MRE 掃描方式掃描檢測。m／z100～1 500，除溶劑氣氮氣；干燥氣溫度350 ℃；體積流量10 L／min；鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓4.0 kV；Fragment 電壓180 V；掃描范圍為m／z100～1 700。

2.2 溶液制備

2.2.1 利血平對照品溶液制備 精密稱取利血平對照品0.025 7 g，置于50 mL 量瓶中，加入甲醇適量溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為0.514 mg／mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液1.0 mL，加入甲醇稀釋定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為51.4 μg／mL 的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 分別取云南蘿芙木、催吐蘿芙木粗粉適量，約1.5 g，精密稱定，精密加入80% 乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲 （250 W，50 kHz） 提取45 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，以利血平峰為參照峰（15 號峰），分別計算15 個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果測得各共有峰相對保留時間RSD 為0.35%，相對峰面積RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批次云南蘿芙木粗粉（批號S2），按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，以利血平峰為參照峰（15 號峰），分別計算15 個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果測得各共有峰相對保留時間RSD 為0.43%，相對峰面積RSD 為0.98%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批次云南蘿芙木粗粉（批號S2），共6 份，分別按照“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣分析。以利血平峰為參照峰（15 號峰），分別計算15 個共有色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果測得各共有峰相對保留時間RSD 為0.41%，相對峰面積RSD 為1.24%，表明該方法重復性良好。

2.4 云南蘿芙木與催吐蘿芙木指紋圖譜建立

2.4.1 共有峰標定 分別取15 批樣品粗粉，分別按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣檢測。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012） ” 對15 批樣品HPLC圖譜進行處理分析，采用多點校正法建立指紋圖譜，選擇中位數(shù)法計算得出對照圖譜（R），見圖1。選擇圖譜中含有量較大、分離較好且穩(wěn)定的15號峰（利血平） 作為參比峰（S 峰），共標定15個共有峰作為共有特征峰。計算15 批樣品各色譜峰相對保留時間與相對保留峰面積，結(jié)果顯示，15批樣品各共有峰相對保留時間RSD 為0.54%，表明各共有峰的出峰時間相對穩(wěn)定。但各共有峰相對保留峰面積RSD 相差較大，表明不同批次藥材各成分含有量存在一定差異。

圖1 15 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of fifteen batches of samples

2.4.2 色譜峰指認 為了盡可能多地了解HPLC指紋圖譜中各成分的化學結(jié)構(gòu)信息，在“2.1.2項” 條件下，對供試品溶液進行分析，根據(jù)各色譜峰在正離子模式下獲得的準分子離子（M＋H）＋，并結(jié)合相關文獻［9?11］對圖譜中15 個共有特征峰的可能化學結(jié)構(gòu)進行推測，結(jié)果見表2。

表2 指紋圖譜共有峰指認Tab.2 Common peak identification of fingerprints

2.4.3 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A） ” 對15 批樣品進行相似度分析。相似度分別為0.95、0.95、0.95、0.85、0.95、0.94、0.92、0.94、0.83、0.95、0.97、0.96、0.97、0.88、0.85。實驗發(fā)現(xiàn)催吐蘿芙木（S4、S9、S14、S15） 與共有模式對照圖譜的相似度范圍在0.83～0.85，云南蘿芙木各批次（S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S13）與共有模式對照圖譜的相似度范圍為0.92～0.97，結(jié)果表明云南蘿芙木與催吐蘿芙木在共有峰化學成分含有量上存在較大差異。

2.5 化學模式識別

2.5.1 聚類分析 以指紋圖譜中標定的15 個共有峰的相對峰面積為變量，采用SPSS 22.0 軟件中的平方Eudidean 距離對15 批樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖2。根據(jù)聚類分析結(jié)果，將15 批樣品大致分為兩類，S4、S9、S14、S15 歸為一類，屬于催吐蘿芙木，S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S13 歸為一類，屬于云南蘿芙木。該分析與相似度評價結(jié)果一致。

圖2 15 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of fifteen batches of samples

2.5.2 主成分分析 對15 批樣品進行主成分分析，以指紋圖譜中標定的15 個共有峰相對峰面積為自變量，以不同批次云南蘿芙木（催吐蘿芙木）為因變量，采用Simca13.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，從主成分分析模式圖見圖3，樣品S4、S9、S14、S15屬于一類，樣品S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S10、S11、S12、S13 在平面圖上屬于另一類，該現(xiàn)象與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 15 批樣品主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis plot for fifteen batches of samples

2.5.3 正交偏最小二乘法?判別分析（OPLS?DA） 為了進一步區(qū)分云南蘿芙木與催吐蘿芙木，并尋找二者之間的差異化合物，進一步采用有監(jiān)督的OPLS?DA 對蘿芙木屬藥材進行分析。以15 個共有峰的峰面積作為輸入變量，以11 批云南蘿芙木樣品和4 批催吐蘿芙木樣品為輸出變量進行OPLS?DA 分析。采用 Simca13.0 軟件建立OPLS?DA 模型。由OPLS?DA 得分圖見圖4，該結(jié)果與主成分分析結(jié)果相似，15 批樣品可以很好地被分為兩類，即云南蘿芙木與催吐蘿芙木。進一步對2 組數(shù)據(jù)的差異性進行整體分析，得到變量權(quán)重重要性排序（VIP） 的預測值見圖5，在0.95 的置信區(qū)間內(nèi)，選取VIP ＞1.5 的化合物作為差異性標志物，差異性色譜峰為F15 與F7，即為利血平與蘿芙木堿。

圖4 15 批樣品OPLS?DA 得分散點圖Fig.4 OPLS?DA score scatter plot of fifteen batches of samples

圖5 15 批樣品主要色譜峰VIP 值Fig.5 VIP plot of chromatographic peaks in fifteen batches of samples

2.5.4 云南蘿芙木與催吐蘿芙木指紋圖譜直觀比較 通過對15 批樣品（云南蘿芙木、催吐蘿芙木） 指紋圖譜進行比較，結(jié)果見圖6，15 個共有峰反映出兩者的主要成分基本一致，但各共有峰的相對峰面積存在一定差異。催吐蘿芙木較云南蘿芙木在保留時間21.5、36.9、38.5 min 處存在較明顯的差異成分，通過液質(zhì)分析及文獻研究，發(fā)現(xiàn)此3 峰分別可能為催吐蘿芙木勒寧 （m／z350.164 2）［11］、利血胺 （m／z634.289 0）［10?11］、carapanaubine （m／z428.194 5）［10］。而云南蘿芙木較催吐蘿芙木在保留時間22.5、28.9、29.6 min處也存在差異成分，通過液質(zhì)分析及文獻研究，發(fā)現(xiàn)此 3 峰 分別可能為 raucaffricine （m／z512.216 5）［12］、匹克拉林堿（m／z410.184 2）［11］、ajmaline?O?hexoside （m／z488.252 4）［10］。

圖6 云南蘿芙木與催吐蘿芙木指紋圖譜比較Fig.6 Comparison of fingerprints chromatogram of R.Yunnanensis and R.vomitoria

2.6 利血平含有量測定

2.6.1 線性關系考察 精密量取利血平對照品貯備液適量（C對＝0.514 mg／mL），按一定比例制備成6 個質(zhì)量濃度的系列混合對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），進行回歸，得方程為Y＝9 376.3X（r＝0.999 9），表明利血平在0.257～5.14 μg 范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6.2 重復性試驗 取同一批樣品粉末（批號S2），共6 份，分別按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣，結(jié)果測得利血平含有量RSD 為1.52%，表明該方法重復性良好。

2.6.3 加樣回收率試驗 取同一批樣品（批號S2） 約0.7 g （每1 g 中含利血平0.46 mg），精密稱定，共6 份，分別精密加入利血平對照品貯備液（C對＝0.514 mg／mL） 0.7 mL，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下測定，結(jié)果見表3。

2.6.4 樣品含有量測定 分別取15 批樣品粉末，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進行測定，計算樣品中利血平含有量，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明云南蘿芙木（S1、S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13）中利血平含有量約為0.3～0.6 mg／g，催吐蘿芙木（S4、S9、S14、S15） 中利血平含有量約為1.7～1.8 mg／g，催吐蘿芙木中利血平含有量明顯高于云南蘿芙木，約為云南蘿芙木利血平含有量的3～4 倍。

表3 利血平加樣回收率實驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for reserpine （n＝6）

圖7 15 批樣品利血平含有量測定結(jié)果Fig.7 Results of content determination of reserpine in fifteen batches of samples

3 討論

本實驗采用二極管陣列檢測器對云南蘿芙木樣品進行全波長掃描，比較了不同波長下 （280、254、210、230、310 nm） 色譜圖的色譜峰數(shù)目與分離度。結(jié)果表明，在280 nm 波長下云南蘿芙木樣品的峰數(shù)目較多且分離度良好，因此檢測波長為280 nm。另外，還分別考察了不同提取溶劑（甲醇、乙醇、80% 乙醇、80% 甲醇、三氯甲烷）、不同提取方法（超聲法、水浴回流法）、不同提取時間（30、45、60 min） 對有效成分提取率的影響，結(jié)果表明80%甲醇超聲45 min 指紋圖譜不同成分提取率最高。

蘿芙木屬藥材主要成分為生物堿，除了替巴因和罌粟堿為非吲哚類生物堿之外，其余89 種均為吲哚類生物堿，包括利血平、育亨賓等［7，13?14］，其中含有量較高并具有經(jīng)濟開發(fā)價值的主要有利血平、育亨賓、蛇根堿等［15?16］。雖然云南蘿芙木與催吐蘿芙木化學成分非常相似，但采用相似度評價、聚類分析、主成分分析、最小偏二乘法回歸分析與指紋圖譜相結(jié)合的方法［17?19］，不僅能體現(xiàn)整體質(zhì)量，也可有效區(qū)分云南蘿芙木與催吐蘿芙木，以期為蘿芙木屬藥材的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)，同時為多基源、多產(chǎn)地中藥的質(zhì)量標準研究提供新思路。

為了更好的辨識云南蘿芙木與催吐蘿芙木之間的質(zhì)量差異，本實驗采用OPLS?DA 篩選出云南蘿芙木與催吐蘿芙木指紋圖譜共有峰中質(zhì)量差異峰2個，其中之一通過對照品指認確定為利血平，另一個通過文獻研究、液質(zhì)分析推測其可能為蘿芙木堿；此外，通過直觀比較蘿芙木與催吐蘿芙木指紋圖譜的差異，發(fā)現(xiàn)除去共有峰外兩者均還存在差異性成分，并通過液質(zhì)分析與文獻對比對其可能成分進行初步指認，但還有待后續(xù)進一步驗證。通過比較云南蘿芙木與催吐蘿芙木藥材中利血平的含有量，發(fā)現(xiàn)催吐蘿芙木中利血平含有量遠遠高于云南蘿芙木，提示其可以作為兩者鑒別的重要依據(jù)。因此，建議在云南蘿芙木與催吐蘿芙木質(zhì)量控制方面，可重點關注以上差異性成分的含有量變化，從而更加快速、科學、準確地評價云南蘿芙木與催吐蘿芙木藥物的質(zhì)量。