王遠(yuǎn)茜 韓 冰 王 丹 王思明 李 娜* 趙大慶*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)， 吉林長(zhǎng)春130117； 2.長(zhǎng)春金賽藥業(yè)股份有限公司， 吉林長(zhǎng)春130012）

黃連膏出自清代吳謙的《醫(yī)宗金鑒》，是用于治療皮膚創(chuàng)面疾病的中醫(yī)經(jīng)典名方，原配方為當(dāng)歸尾五錢、黃連三錢、黃柏三錢、生地一兩、姜黃三錢，按照清代度量衡制度結(jié)合2015 年版《中國(guó)藥典》 計(jì)量單位，將其換算為黃連11.175 g、當(dāng)歸尾18.625 g、生地黃37.250 g、黃柏11.175 g、姜黃11.175 g，總生藥量89.4 g。方中姜黃破血行氣，當(dāng)歸活血養(yǎng)血，生地清熱生津、涼血養(yǎng)陰潤(rùn)燥，黃連清熱燥濕，黃柏瀉火解毒［1］，攻效清熱癤腫、清熱解毒、潰瘍創(chuàng)傷，主要用于治療肺經(jīng)壅熱、上攻鼻竅，致生鼻瘡、干燥腫疼等，對(duì)皮膚濕疹、水火燙傷、紅腫熱瘡、乳頭碎痛也有理想療效。近年來(lái)，該方在治療新生兒紅臀、痔瘡、燒燙傷、壓瘡、粉刺等也呈現(xiàn)了良好作用，堪稱中醫(yī)外科之“圣藥”［2?3］。

黃連膏以清利濕熱為組方原則，對(duì)濕疹的治療有著悠久歷史［4］。濕疹是由多種因素引起真皮淺層、表皮炎癥的皮膚病，目前市面上常用藥物以西藥為主，但大多含有激素類成分，具有較大的不良反應(yīng)；中藥膏劑治療濕疹具有不良反應(yīng)小、療效好、不易復(fù)發(fā)的優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)皮膚涂抹使藥物直達(dá)病所，不僅能透達(dá)腠理來(lái)發(fā)揮局部治療作用，還可經(jīng)過(guò)肌膚、毛竅而深入臟腑，從而起到內(nèi)外合治的目的［5?6］。本實(shí)驗(yàn)將優(yōu)化黃連膏提取工藝，并選擇人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCat 細(xì)胞） 作為對(duì)象對(duì)該方體外抗炎作用進(jìn)行研究，以期為今后相關(guān)機(jī)制的考察提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)3131）；酶標(biāo)儀 （瑞士Tecan 公司，型號(hào)infinite M200 PRO）；電子天平（瑞士梅特勒?托利多公司，型號(hào)AL204）；粉碎機(jī)（北京錕捷玉誠(chéng)機(jī)械設(shè)備有限公司，型號(hào)GS?05）；高效液相色譜儀 （美國(guó)Agilent 公司，型號(hào)1100）。

1.2 試劑與藥物 姜黃、當(dāng)歸、生地、黃連、黃柏均購(gòu)自宏檢大藥房，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室王哲副教授鑒定為正品。香油 （燕莊牌）。MEM 培養(yǎng)基 （美國(guó)HyClone 公司，貨號(hào)SH30022.01）；胎牛血清 （貨號(hào)04?002?1ACS）、1%雙抗（貨號(hào)03?031?1B）（美國(guó)BI 公司）；0.25%胰 酶?EDTA （美 國(guó) MRC 公 司，貨 號(hào)CC830031.02）；MTT 試劑盒（北京Solarbio 公司，貨號(hào)M8180）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號(hào)PR047A）；TRIzol （美國(guó)羅氏公司，貨號(hào)11667165001）；人腫瘤壞死因子?α （TNF?α）、人干擾素?γ （IFN?γ） 細(xì)胞因子（美國(guó)Biolegend 公司，貨號(hào)300?01A?10、300?02?20）；胸腺活化調(diào)節(jié)趨化因子 （TARC）、巨噬細(xì)胞源性趨化因子（MDC）、調(diào)節(jié)活化T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子（RAN?TES）、白細(xì)胞介素?8 （IL?8） ELISA 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司，貨號(hào) BPE10052、BPE10132、BPE10120、BPE10139）。

1.3 細(xì)胞株 人正常表皮永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCat 細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素總量測(cè)定 姜黃為黃連膏君藥，其藥理作用廣泛，無(wú)毒，耐受性好，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化等作用［7］，主要有效成分為姜黃素，在治療炎癥介導(dǎo)的疾病中有著重要地位，并且《中國(guó)藥典》 相關(guān)檢測(cè)方法實(shí)用性強(qiáng)，易于操作。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇姜黃素作為指標(biāo)成分［8］。

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相乙腈-4% 冰醋酸 （48 ∶52）；體積流量1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm；進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)按姜黃素峰計(jì)算，應(yīng)不低于4 000［9］。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取姜黃素對(duì)照品1.20 mg，甲醇制成每1 mL 含12 μg 該成分的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取黃連膏提取油5.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，75 ℃水浴加熱回流提取30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以姜黃素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝3 509.2X-3.293 3 （r＝0.999 8），在0.036～0.216 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密稱取黃連膏提取油5.0 g，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，每次5 μL，測(cè)得姜黃素峰面積RSD 為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，每次5 μL，測(cè)得姜黃素峰面積RSD 為0.72%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批黃連膏提取油6 份，每份5.0 g，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各吸取5 μL，在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得姜黃素總量RSD 為1.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取黃連膏提取油5.0 g，共6 份，精密加入等量對(duì)照品溶液，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得姜黃素平均加樣回收率為99.1%，RSD 為0.51%。

2.2 提取工藝優(yōu)化 依據(jù)《醫(yī)宗金鑒》 提取工藝，取香油十二兩（即加入5 倍量香油，每個(gè)處方447 g），將藥“煠枯” 后撈去渣，選擇藥材粒度、煎炸時(shí)間、煎炸溫度、浸泡時(shí)間作為影響因素，姜黃素總量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝［10］。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

方差分析見表3，可知因素B、C對(duì)提取有顯著影響 （P＜0.05），而因素A、D無(wú)顯著影響（P＞0.05）；各因素影響程度依次為B＞C＞A＞D，故確定D作為誤差項(xiàng)。由表2 可知，最優(yōu)工藝為A1B2C2D2，為了節(jié)省成本，縮短生產(chǎn)周期，最終確定為A1B2C2D1，即飲片不浸泡而直接投入5 倍量香油中，200 ℃下煎炸4 h。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

再進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)。按處方取10 倍量飲片，共3 份，按上述優(yōu)化工藝提取，撈出炸枯的藥渣，濾過(guò)，測(cè)定提取油質(zhì)量和姜黃素總量，結(jié)果見表4，可知工藝穩(wěn)定可靠。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests （n＝3）

2.3 體外抗炎活性研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及模型建立 采用含1% 雙抗、15%胎牛血清的MEM／EBSS 液體培養(yǎng)基，將HaCat細(xì)胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，在飽和濕度培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2） 中培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)液，除去未貼壁細(xì)胞，每隔1～2 d 更換1 次培養(yǎng)液至細(xì)胞生長(zhǎng)融合，待細(xì)胞貼壁達(dá)到70%～80% 時(shí)，用0.25%EDTA?胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代［11］。

由于血清可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，從而影響體外濕疹模型的建立，故采用血清饑餓法建立體外濕疹炎癥模型［12］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCat 細(xì)胞，按每孔4 000 個(gè)細(xì)胞量均勻接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清空白培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞6 h，再更換含有不同造模濃度細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白培養(yǎng)基組、10 ng／mL TNF?α ＋10 ng／mL IFN?γ 組、20 ng／mL TNF?α ＋20 ng／mL IFN?γ 組、30 ng／mL TNF?α ＋30 ng／mL IFN?γ 組、40 ng／mL TNF?α ＋40 ng／mL IFN?γ 組，每組設(shè)6 個(gè)副孔，培養(yǎng)結(jié)束后加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為存活率＝OD藥物／OD空白×100%，篩選LD50時(shí)的造模濃度［13］。

采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，發(fā)現(xiàn)不同造模濃度TNF?α、IFN?γ 對(duì)HaCat 細(xì)胞存活率影響的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并隨著造模濃度升高而逐漸降低（P＜0.05）。圖1 顯示，當(dāng)造模濃度為20 ng／mL 時(shí)，細(xì)胞存活率為50%，即為L(zhǎng)D50。

圖1 造模濃度對(duì)HaCat 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of modeling concentration on the survival rate of HaCat Cells

2.3.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 0.25% EDTA?胰蛋白酶消化HaCat 細(xì)胞后，MEM 完全培養(yǎng)基吹打稀釋成濃度為4×104／mL 的細(xì)胞懸液，以每孔100 μL 的體積加到96 孔板中，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后棄去完全培養(yǎng)基，加入空白培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)6 h，再加入含0.05、0.5、1、2 μL／mL黃連膏提取油的MEM 空白培養(yǎng)基各100 μL，以MEM 空白培養(yǎng)基為空白對(duì)照組［14］，每組平行設(shè)置6 個(gè)副孔，作用24 h 后每孔加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去原培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO 溶解，振蕩3 min 使結(jié)晶物充分溶解，在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率，結(jié)果見圖2。由此可知，提取油濃度為2 μL／mL 時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用（P＜0.01），存活率為77%，而在0.05～1 μL／mL時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性，故最終選擇0.05、0.5、1 μL／mL作為實(shí)驗(yàn)濃度。

圖2 黃連膏提取油對(duì)HaCat 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of Huanglian Ointment extract oils on the survival rate of HaCat cells

2.3.3 TARC、MDC、RANTES、IL?8 水平檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCat 細(xì)胞，接種于6 孔板中（每孔7×104個(gè)） 培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞4 h，棄去空白培養(yǎng)基，以MEM 空白培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，加入含“2.3.1”項(xiàng)造模濃度TNF?α、IFN?γ 及0.05、0.5、1 μL／mL黃連膏提取油的無(wú)血清培養(yǎng)基，處理細(xì)胞24 h，收集每孔上清培養(yǎng)基，1 000 r／min 離心5 min 以去除細(xì)胞碎片，ELISA 法檢測(cè)上清培養(yǎng)基中TARC、MDC、RANTES、IL?8 水平［15］。圖3 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理HaCat 細(xì)胞后TARC 水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而黃連膏提取油對(duì)其水平有較強(qiáng)的抑制作用，并呈劑量依賴性（P＜0.01）。

圖3 黃連膏提取油對(duì)TARC 水平的影響Fig.3 Effect of Huanglian Ointment extract oils on TARC level

圖4 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理HaCat 細(xì)胞后MDC 水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而黃連膏提取油對(duì)其水平有較強(qiáng)的抑制作用 （P＜0.05，P＜0.01），以1 μL／mL 更明顯。

圖4 黃連膏提取油對(duì)MDC 水平的影響Fig.4 Effect of Huanglian Ointment extract oils on MDC level

圖5 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理后RANTES 水平高于空白對(duì)照組（P＜0.05），而1 μL／mL 黃連膏提取油對(duì)其水平有較強(qiáng)的抑制作用（P＜0.01）。

圖5 黃連膏提取油對(duì)RANTES 水平的影響Fig.5 Effect of Huanglian Ointment extract oils on RANTES level

圖6 顯示，TNF?α、IFN?γ 處理后IL?8 水平高于空白對(duì)照組 （P＜0.05），而 0.05、0.5、1 μL／mL黃連膏提取油對(duì)其水平有較強(qiáng)的抑制作用（P＜0.01）。

圖6 黃連膏提取油對(duì)IL?8 水平的影響Fig.6 Effect of Huanglian Ointment extract oils on IL?8 level

3 討論

傳統(tǒng)上，皮質(zhì)類固醇（軟膏、乳膏或注射劑）被認(rèn)為是治療濕疹最有效的方法［16］，但其長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起不良反應(yīng)，導(dǎo)致臨床上受到限制［17?18］，故迫切需要開發(fā)相關(guān)新型藥物。濕疹發(fā)病機(jī)制與角質(zhì)形成細(xì)胞作用的失調(diào)有關(guān)，促炎細(xì)胞因子對(duì)后者的刺激可引起炎性趨化因子產(chǎn)生，可專門用于招募效應(yīng)細(xì)胞（如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞），從而促進(jìn)皮損炎癥反應(yīng)的發(fā)展［19?20］。

本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)黃連膏提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)各因素對(duì)姜黃素總量的影響程度依次為煎炸時(shí)間＞煎炸溫度＞藥材粒度＞浸泡時(shí)間，其中煎炸時(shí)間、煎炸溫度更顯著；由直觀分析結(jié)果可知，最優(yōu)提取工藝為將藥材飲片直接投入5 倍量香油中，200 ℃下煎炸4 h。驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，該工藝準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定可行，具有實(shí)際利用價(jià)值，可使古方工藝中的“將藥煠枯” 操作標(biāo)準(zhǔn)化，為經(jīng)典名方黃連膏的新劑型開發(fā)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，炎性趨化因子TARC、MDC 水平隨著黃連膏提取油濃度升高而降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性，同時(shí)高濃度（1 μL／mL）下IL?8、RANTES 水平基本恢復(fù)正常。由此可知，黃連膏可明顯抑制炎癥介質(zhì)釋放，減輕表皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)皮膚屏障恢復(fù)［21］。