謝俊，梁先春，唐永梁

陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院（野戰(zhàn)外科研究所）肝膽外科，重慶 400042

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是一類發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)管細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率在所有惡性腫瘤中均排在前列[1-2]。大部分PHC患者在中晚期才被檢查發(fā)現(xiàn)，因此只有極少部分PHC患者能夠進(jìn)行切除手術(shù)，更多的患者只能選擇肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）進(jìn)行保守治療以延長(zhǎng)生存時(shí)間[3-4]。TACE為中晚期PHC患者的主要治療方式，但依然有部分患者介入效果不佳，需要反復(fù)多次介入治療[5]，因此臨床上需要一種無(wú)創(chuàng)、安全評(píng)估TACE療效的方式。腫瘤特異性生長(zhǎng)因子（tumor specific growth factor，TSGF）因?yàn)閷?duì)腫瘤判斷的高靈敏度而被臨床用于評(píng)估腫瘤治療效果[6]。目前研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并且與治療反應(yīng)和療效預(yù)測(cè)等關(guān)系密切，miRNA-214作為miRNA家族中的成員，在多種不同組織來(lái)源腫瘤中均異常表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中，其水平顯著降低[7]。本研究旨在探討血清中TSGF、miRNA-214水平在TACE術(shù)前術(shù)后的變化情況，并分析其水平對(duì)TACE遠(yuǎn)期療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2015年12月陸軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院收治的需行TACE治療的PHC患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①穿刺獲取組織并經(jīng)臨床和病理學(xué)診斷確診為PHC[8]；②無(wú)法進(jìn)行肝癌切除術(shù)；③甲胎蛋白≥400 μg/L；④生存時(shí)間≥3個(gè)月；⑤首次進(jìn)行TACE術(shù)且無(wú)手術(shù)、化療、免疫治療及靶向治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙；②合并其他類型惡性腫瘤；③甲胎蛋白陰性肝癌；④合并嚴(yán)重凝血功能障礙；⑤臨床資料不完整。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入87例PHC患者，其中男47例，女40例；年齡（42.35±10.52）歲，中位年齡49.74歲。

1.2 TACE 治療方法及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

保持患者臥位并選擇體右側(cè)下肢動(dòng)脈作為穿刺點(diǎn)，進(jìn)行局部麻醉后采用Seldinger技術(shù)對(duì)動(dòng)脈進(jìn)行穿刺，在腹腔動(dòng)脈、肝動(dòng)脈、腸系膜上動(dòng)脈處置管進(jìn)行血管造影，找到腫瘤的明確供血?jiǎng)用}，并對(duì)病灶數(shù)目、血供情況、有無(wú)血管侵犯及動(dòng)靜脈瘺進(jìn)行觀察。選取5F肝管超選擇插管至肝固有動(dòng)脈，注入適量化療藥物及超液化碘油混合乳劑進(jìn)行栓塞。進(jìn)行肝動(dòng)脈造影確定病灶處血供清況，效果滿意后拔除導(dǎo)管，進(jìn)行常規(guī)傷口包扎，術(shù)后給予保肝、增強(qiáng)免疫及對(duì)癥治療。

治療期間根據(jù)影像學(xué)結(jié)果評(píng)價(jià)療效[9]，復(fù)查間隔時(shí)間為4～8周。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：完全緩解，肝臟腫瘤完全消失且無(wú)新病灶出現(xiàn)；部分緩解，肝臟腫瘤最大直徑減?。?0%，且維持時(shí)間超過(guò)4周；穩(wěn)定，肝臟腫瘤最大直徑減小≤30%，增大≤20%；進(jìn)展，肝臟腫瘤最大直徑增大＞20%或有新的病灶出現(xiàn)。病情控制=完全緩解+部分緩解+穩(wěn)定。

1.3 觀察指標(biāo)

所有PHC患者均于TACE前1天和治療后1個(gè)月抽取外周血5 ml于抗凝管中，離心取上清后分為兩部分，一部分保存于-20℃用于TSGF測(cè)定，一部分保存于-8℃用于miRNA-214測(cè)定。TSGF測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定血清中TSGF水平，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santacruz公司；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終檢測(cè)結(jié)果。miRNA-214測(cè)定：按照RNA提取試劑盒中說(shuō)明書(shū)操作步驟提取血清中的總RNA，提取后用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)，光密度（optical density，OD）值（A260/A280）=1.8～2.1，并用凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性；符合標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA合成，反轉(zhuǎn)錄體系（10 μl）：2×miRNA反應(yīng)混合液5 μl，0.1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）1 μl，miRNA Prime Script?RT酶混合物1 μl，總 RNA 0.5 μl，去 RNA 酶 ddH2O 2.5 μl；反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4℃ 30 min。cDNA獲取后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)，PCR 體系（10 μl）：SYBR?Prmix Ex TapⅡ（2×）5 μl，上游引物 0.4 μl，下游引物 0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μl，cDNA1 μl，ddH2O 3 μl，詳細(xì)操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)；PCR反應(yīng)條件：50℃激活聚合酶5 min，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃15 s，內(nèi)參基因采用β-actin。每個(gè)樣孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取 Ct平均值進(jìn)行分析，以 2-△△Ct表示相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪情況

患者自治療出院后開(kāi)展隨訪工作，治療后1年內(nèi)每3個(gè)月門(mén)診復(fù)查1次，2年內(nèi)每半年復(fù)查1次，以后至少每年復(fù)查1次，所有患者隨訪時(shí)間一致。隨訪記錄生存時(shí)間及隨訪時(shí)狀態(tài)（生存、死亡或其他）等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）評(píng)價(jià)血清TSGF、miRNA-214水平對(duì)TACE療效的預(yù)測(cè)價(jià)值；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較生存情況。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病情控制組和病情進(jìn)展組患者臨床特征的比較

根據(jù)TACE術(shù)后療效將87例PHC患者分為病情控制組（56例）和病情進(jìn)展組（31例）。病情控制組中，男性33例，女性23例；年齡37～75歲，平均（58.31±9.24）歲；巴塞羅那肝癌臨床（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期：B期38例，C期18例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)49例，B級(jí)7例；腫瘤主要病灶直徑5.25～10.43 cm，平均（8.94±2.61）cm。病情進(jìn)展組中，男性22例，女性9例；年齡45～81歲，平均（65.47±8.68）歲；BCLC分期：B期19例，C期12例；Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)23例，B級(jí)8例；腫瘤主要病灶直徑5.52～11.81 cm，平均（8.56±3.29）cm。

2.2 TACE 治療前后血清TSGF、miRNA-214水平的比較

TACE治療前，病情控制組與病情進(jìn)展組患者TSGF、miRNA-214表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TACE治療后，兩組患者TSGF表達(dá)水平均下降，miRNA-214表達(dá)水平均升高，且病情控制組患者TSGF表達(dá)水平低于病情進(jìn)展組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 TACE治療前后兩組患者血清TSGF、miRNA-214水平的比較（±s）

表1 TACE治療前后兩組患者血清TSGF、miRNA-214水平的比較（±s）

注：a與本組治療前比較，P＜0.05；b與同時(shí)間病情進(jìn)展組比較，P＜0.05

指標(biāo)T S G F（U/m l）m i R N A-2 1 4治療前治療后治療前治療后1 8 9.2 1±1 5.1 4 1 3 4.2 6±1 0.2 6 a 0.5 6±0.1 8 1.1 4±0.2 9 a 1 7 1.5 7±1 3.5 8 9 4.2 6±1 1.3 7 a b 0.8 4±0.1 9 1.5 9±0.2 2 a時(shí)間病情進(jìn)展組（n=3 1）病情控制組（n=5 6）

2.3 血清TSGF、miRNA-214表達(dá)水平預(yù)測(cè)TACE療效的ROC曲線

ROC曲線結(jié)果顯示，TSGF、miRNA-214表達(dá)水平預(yù)測(cè)TACE術(shù)后病情控制的AUC分別為0.849（95% CI=0.759～0.938）、0.807（95% CI=0.707～0.907），Cut-off值分別為181.32 U/ml、0.63。（圖1）

2.4 血清TSGF、miRNA-214表達(dá)水平與患者生存情況的關(guān)系

圖1 血清TSGF、miRNA-214水平預(yù)測(cè)TACE療效的ROC曲線

87例患者3年內(nèi)死亡43例，生存率為50.57%（44/87）。根據(jù)Cut-off值將87例PHC患者分為高TSGF組（43例）、低TSGF組（44例）和miRNA-214高表達(dá)組（47例）、miRNA-214低表達(dá)組（40例）。Kaplan-Meier曲線結(jié)果顯示，低TSGF組患者的3年生存率為70.45%（31/44），高于高TSGF組的30.23%（13/43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.014，P=0.025）；miRNA-214高表達(dá)組患者的3年生存率為61.70%（29/47），明顯高于miRNA-214低表達(dá)組的37.50%（15/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.928，P=0.008）。（圖2、圖3）

圖2 高TSGF組（n=43）及低TSGF組（n=44）患者的生存曲線

圖3 miRNA-214高表達(dá)組（n=47）及miRNA-214低表達(dá)組（n=40）患者的生存曲線

3 討論

隨著TACE技術(shù)的不斷成熟，其在臨床普及迅速，有利于中晚期PHC患者的治療，但由于單次介入治療往往無(wú)法徹底消除病灶，因此介入治療后的療效評(píng)價(jià)成為了后續(xù)治療的關(guān)鍵所在[10]。目前臨床用于評(píng)價(jià)TACE術(shù)后療效的主要方式是影像學(xué)檢查和實(shí)驗(yàn)室檢查，然而影像學(xué)檢查存在一些缺陷，例如超聲檢查對(duì)于病灶較小的復(fù)發(fā)灶檢出率較低，計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）檢查容易混淆碘油沉積和強(qiáng)化的腫瘤病灶，不利于殘留病灶的判斷，磁共振成像（MRI）雖然檢出率高，但由于其檢查費(fèi)用偏高，故而使用較受限[11]。實(shí)驗(yàn)室檢查使用最多的是甲胎蛋白，但由于存在甲胎蛋白陰性肝癌，其對(duì)TACE術(shù)后療效的預(yù)測(cè)價(jià)值存在較多的爭(zhēng)議[12]。因此尋找方便、快捷的血液腫瘤標(biāo)志物用于預(yù)測(cè)和評(píng)估患者的預(yù)后情況是目前肝癌研究的重點(diǎn)所在。

TSGF是惡性腫瘤生長(zhǎng)及擴(kuò)散過(guò)程中生成的一類生長(zhǎng)因子，有利于促進(jìn)腫瘤及周圍組織毛細(xì)血管生成及增殖，同時(shí)還會(huì)釋放上皮生長(zhǎng)因子及干細(xì)胞生長(zhǎng)因子等至血液中，因此血清中的TSGF水平對(duì)于腫瘤的診斷和預(yù)后有非常高的應(yīng)用價(jià)值[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TACE治療后病情進(jìn)展患者的TSGF水平高于病情控制患者，且治療后TSGF水平也降低，表明血清TSGF水平在評(píng)價(jià)TACE術(shù)后療效上具有一定的價(jià)值。馬穎等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PHC患者TACE術(shù)后TSGF水平顯著降低，與本研究結(jié)果一致。既往研究認(rèn)為，miRNA會(huì)被細(xì)胞外存在的RNA酶降解，但后來(lái)研究證明miRNA可以廣泛而穩(wěn)定地存在于細(xì)胞外液中，因此檢測(cè)外周血中的miRNA表達(dá)情況在惡性腫瘤的診斷和防治中得到了廣泛研究[15]。有研究表明，miRNA-214在不同來(lái)源腫瘤組織中的表達(dá)存在差異，例如其在胃癌、胰腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，在肝細(xì)胞肝癌中顯著下調(diào)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TACE治療后病情進(jìn)展患者miRNA-214表達(dá)水平低于病情控制患者，術(shù)后miRNA-214水平也增高，表明血清miRNA-214表達(dá)水平在評(píng)價(jià)TACE術(shù)后療效上具有一定的價(jià)值。陳琳等[17]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者外周血中miRNA-214表達(dá)水平顯著升高，并且miRNA-214高表達(dá)患者的預(yù)后不佳，與本研究結(jié)果相反，可能與miRNA-214的組織特異性表達(dá)相關(guān)。

本研究利用ROC曲線評(píng)估了TSGF、miRNA-214表達(dá)水平預(yù)測(cè)TACE療效的價(jià)值，發(fā)現(xiàn)TSGF、miRNA-214表達(dá)水平預(yù)測(cè)TACE療效的AUC值均超過(guò)了0.800，表明TSGF、miRNA-214表達(dá)水平均具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，且TSGF水平為181.32 U/ml、miRNA-214表達(dá)水平為0.63的時(shí)候，約登指數(shù)最大。根據(jù)Cut-off值將患者分為高TSGF組、低TSGF組和miRNA-214高表達(dá)組、miRNA-214低表達(dá)組，Kaplan-Meier曲線結(jié)果顯示低TSGF組的3年生存率高于高TSGF組，miRNA-214高表達(dá)組的3年生存率高于miRNA-214低表達(dá)組。表明血清中TSGF、miRNA-214表達(dá)水平與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系密切。

綜上所述，TACE作為中晚期肝癌患者的主要治療手段，方便、快捷地評(píng)價(jià)TACE療效的指標(biāo)對(duì)其后續(xù)治療具有積極意義，本研究結(jié)果顯示血清TSGF、miRNA-214表達(dá)水平均具有較高的預(yù)測(cè)TACE療效的價(jià)值，并且與患者遠(yuǎn)期預(yù)后關(guān)系也較為密切，值得臨床推廣。