胡星明，陳躍軍，王子堯，方理，周彬，吳安邦，肖高明

湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學湘雅醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，長沙 410005

肺腺癌是一種非小細胞肺癌，非小細胞肺癌約占全部肺癌的80%，其中約50%是肺腺癌[1]。肺腺癌是女性亞洲人和45歲以下人群中最常見的肺癌類型，而且更可能發(fā)生于非吸煙者，遺傳、被動吸煙等也可能是病因。有報道顯示，肺腺癌發(fā)生的分子改變包括ALK[2-3]、ROS1[4-5]、RET[6-8]基因重排以及EGFR、HER2、KRAS、ALK、BRAF、PIK3CA、MET基因突變。由于腫瘤信號通路較為復雜，因此仍有大量的研究工作需要進行。有研究報道，抑微管裝配蛋白 1（stathmin 1，STMN1）是細胞質(zhì)磷酸化蛋白，可以調(diào)節(jié)微管動力學，與腫瘤發(fā)生發(fā)展和微管結(jié)合抗癌藥物的耐藥性有關(guān)[9]。不同的細胞外信號能夠?qū)е虏煌牧姿峄愋停缛橄侔┲蠸TMN1 Ser25和Ser38磷酸化是維持細胞運動所必須的，與患者的無瘤生存期較短有關(guān)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）是一種新型Ser25/Ser38磷酸化STMN1結(jié)合蛋白，這種依賴磷酸化的相互作用受甲乙酮（methyl ethyl ketone，MEK）激酶調(diào)節(jié)和STMN1-GRP78復合物穩(wěn)定性及STMN1介導的遷移所影響。磷酸化STMN1和GRP78也被認為可評估乳腺癌的轉(zhuǎn)移風險。有報道顯示，STMN1高表達與食管鱗狀細胞癌、肺腺癌、子宮內(nèi)膜癌的預后差有關(guān)，而GRP78也與一些藥物作用有關(guān)[10]。本研究分析了肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達情況及與患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月1日至2015年12月31日于湖南省腫瘤醫(yī)院胸外科接受手術(shù)治療的肺腺癌患者。納入標準：術(shù)前均未接受過化療、放療等治療；術(shù)前經(jīng)支氣管窺鏡或腫塊穿刺標本病理檢查確診為肺腺癌。排除標準：合并其他類型肺癌；合并其他器官惡性腫瘤；腫瘤已轉(zhuǎn)移。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入51例肺腺癌患者，其中，男37例，女14例；年齡為44～72歲，中位年齡為59歲。收集肺腺癌患者的肺腺癌組織51例。同時選取27例正常肺組織作為對照，包括肺良性病變組織18例和癌旁正常肺組織9例。其中，男20例，女7例；年齡為43～71歲，中位年齡為58歲。51例肺腺癌組織與27例正常肺組織對應患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑

GRP78 BiP抗體和STMN1抗體均購自美國Abcam公司，工作液濃度均為1∶100。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色試劑盒及相應二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，3%過氧化氫孵育20min，PBS沖洗后，置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中微波處理進行抗原修復，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加封閉血清，37℃孵育20 min，滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB溶液顯色；自來水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學染色結(jié)果判定標準

STMN1和GRP78陽性細胞表現(xiàn)為細胞膜或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。由病理科高級醫(yī)師對免疫組織化學染色結(jié)果進行評價。依據(jù)陽性細胞百分比評分：0%～4%的陽性細胞記為0分，5%～25%的陽性細胞記為1分，26%～50%的陽性細胞記為2分，51%～75%的陽性細胞記為3分，＞75%的陽性細胞記為4分。依據(jù)染色強度評分：無染色或邊緣染色記為0分，淺黃色記為1分，黃色記為2分，棕褐色記為3分。陽性細胞百分比評分與染色強度評分相加，0分記為（-），1～4分記為（+），5～8分記為（++），9～12分記為（+++），其中0分為陰性，其余為陽性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關(guān)分析法進行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織及正常肺組織中STMN1和GRP78的表達情況

STMN1和GRP78陽性表達呈棕黃色（圖1）。肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率分別為66.7%（34/51）和60.8%（31/51），分別明顯高于正常肺組織的18.5%（5/27）和22.2%（6/27），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=16.370、10.528，P＜0.01）。肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達呈正相關(guān)（r=0.455，P＜0.05）。

圖1 肺腺癌組織和正常肺組織中STMN1和GRP78的表達情況（免疫組織化學染色，×20）

2.2 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78表達情況的比較

不同性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=9.82、8.56，P＜0.05）。不同分化程度、TNM分期肺腺癌患者肺腺癌組織中GRP78的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=14.89、13.65，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達情況（n=51）

3 討論

本研究對肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達情況及臨床意義進行了初步研究。結(jié)果顯示，肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率分別為66.7%和60.8%，分別明顯高于正常肺組織的18.5%和22.2%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達呈正相關(guān)（r=0.455，P＜0.05）。提示STMN1和GRP78可能與肺腺癌的發(fā)生有關(guān)。研究報道顯示STMN1在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[11]。研究表明，STMN1高表達與食管鱗狀細胞癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管浸潤和靜脈侵犯有關(guān)，STMN1高表達患者的生存率低于STMN1低表達患者，STMN1高表達與新輔助放化療的反應性差有關(guān)，抑制STMN1的表達可增強食管鱗狀細胞癌對放化療的敏感性[12]。

本研究結(jié)果還顯示，不同性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。分化程度越低，STMN1和GRP78的陽性表達率越高；臨床分期越晚，STMN1和GRP78的陽性表達率越高。有一些研究支持這些結(jié)果，如抑微管裝配蛋白（stathmin）過表達與淋巴管浸潤、分期晚、生存率低有關(guān)[13]。有報道認為血清stathmin水平是肺癌尤其是進展期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌的潛在生物標志物[14]。stathmin表達情況與子宮內(nèi)膜癌患者的無瘤生存期和總生存期顯著相關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，下咽鱗狀細胞癌組織中STMN1表達水平明顯升高，且其表達水平與分化程度、臨床分期、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存率等因素有關(guān)；體外實驗表明，STMN1能夠促進下咽鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移，且與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)[16]。另有研究表明，口腔鱗狀細胞癌中stathmin過表達，且其表達情況與性別、TNM分期、分化程度、生存期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)[17]。STMN1也在膽囊癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。

關(guān)于GRP78與肺腺癌關(guān)系的研究較少，有報道認為該分子參與一些化學物質(zhì)的抗腫瘤作用。如血根堿和淫羊藿苷均具有抗肺腺癌的作用，研究發(fā)現(xiàn)二者的作用均涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應急相關(guān)分子如GRP78的表達改變[19-20]。伴侶蛋白L-異天冬氨酸（D-天冬氨酸）O-甲基轉(zhuǎn)移酶的高表達出現(xiàn)在晚期肺腺癌患者中，與GRP78調(diào)節(jié)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關(guān)，提示預后差[21]。有研究顯示，STMN1在肝癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌等惡性腫瘤中癌基因作用的發(fā)揮受多種微小RNA（microRNA，miRNA）的調(diào)控，表明在肺腺癌中可能存在其他機制調(diào)控STMN1的表達[22]。此外，CDC2蛋白抑制劑purvalanol A可通過癌蛋白18（oncoprotein 18，Op18）/stathmin信號通路增強紫杉醇的毒性作用[23]。

綜上所述，STMN1和GRP78的高表達與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是肺腺癌發(fā)生中的重要信號分子。