潘新平,田 立

(定西市人民醫(yī)院腫瘤科,甘肅定西 743000)

胃癌作為惡性腫瘤之一，是與癌癥相關的第二大常見死亡原因[1]。遺憾的是，早期胃癌很難診斷，患者通常無特異癥狀，因此該病的早期診斷存在一定困難。為了給分子治療提供基礎，有必要對胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制進行了解[2]。微小RNA(miRNA)是體積較小(<20 bp)的非編碼RNA家族成員之一，miRNA與靶mRNA結合，通過控制翻譯、增加靶mRNA的降解、促進轉錄后翻譯3種途徑調控蛋白表達[3]。每個miRNA都有數(shù)百個靶區(qū)，可以調節(jié)大多數(shù)遺傳途徑，并可同30%的人類基因結合。已有研究表明，下調miR-193-3p可通過調控PTEN基因抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和化療耐藥[4]。然而在胃癌細胞中miR-193-3p與細胞凋亡的相關研究尚未明了[5]?；诖?，本研究旨在探討miR-193a-3p在胃癌中調節(jié)細胞凋亡的分子機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 pMir-Glo utr1質粒購自廣州基旦生物科技有限公司(貨號：JD190929001M)。RPMI-1640培養(yǎng)基購自北京市普京康利科技有限公司(貨號：PM150110)。胎牛血清(FBS)購自上海中喬新舟生物科技有限公司(貨號：0025)。PAK4,GAPDH,cleaved-capase3抗體購自Abcam公司(貨號：ab62509,ab37168,ab2302)。蛋白酶抑制劑Cocktail 購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司(貨號：HY-K0010)。HiGene轉染試劑購自廣州市左克生物科技發(fā)展有限公司(貨號：C1506)。磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京華夏遠洋科技有限公司(貨號：C0221A)?？焖俣c突變試劑盒購自杭州開泰生物技術有限公司(貨號：KM101)。2×預混快速實時熒光定量PCR試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司(貨號：A301-01)。青鏈霉素混合液(100×)購自北京強欣博瑞生物技術有限公司(貨號：CC014a)。逆轉錄試劑盒購自深圳市凱聯(lián)生物技術有限公司(貨號：205313)。2×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白電泳上樣緩沖液購自上海甄準生物科技有限公司(貨號：ZZR-E270-1ML)。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司(貨號：CDLG-4997)。蛋白裂解液購自碧云天生物技術有限公司(貨號：P0013)。miR-193a-3p類似物，miR-193a-3p抑制劑均由上海生工合成?？俁NA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司(貨號：R1200-100T)。健康人胃黏膜細胞系GES-1購自北京博蕾德國際貿易有限公司(貨號：CX0441)。人胃癌細胞系MKN-45購自成都乾辰生物醫(yī)藥科技有限公司(貨號：CX0439)。人胃癌細胞系SGC-7901購自深圳市譯碼生物科技有限公司(貨號：100674)。人胃癌細胞系MGC-803購自廣州永諾生物科技有限公司(貨號：CC0404)。人胃癌細胞系SNU16購自上海信裕生物科技有限公司(貨號：XY-H0797)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉染 將正常人胃黏膜細胞系GES-1作為對照組，人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803、SNU16在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入10% FBS、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素，在37 ℃含5% CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。將miR-193a-3pp類似物或miR-193a-3p抑制劑同HiGene轉染試劑以1∶3的比例混合，在室溫下靜置20 min后緩慢滴入人胃癌細胞MGC-803的培養(yǎng)基中。

1.2.2RNA提取與實時熒光定量PCR 采用總RNA提取試劑盒聯(lián)合DNase處理從健康人胃黏膜細胞系GES-1、人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803、SNU16中提取總RNA，并采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。使用快速實時熒光定量PCR預混體系試劑盒進行實時熒光定量PCR。使用內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)序列檢測系統(tǒng)進行定量PCR分析。使用GAPDH比較相對量化的mRNA水平，并采用2-ΔΔct法進行相關運算。

1.2.3免疫印跡試驗 細胞在RIPA緩沖液(50 mmol/L Tris-base,1.0 mmol/L EDTA,150 mmol/L NaCl,0.1% SDS,1% Triton X-100,1%脫氧膽酸鈉，1mm PMSF)中溶解。裂解液在4 ℃下、以12 000×g離心10 min。用Bradford法測定蛋白濃度。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離等量的蛋白，然后轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。將膜清洗、堵塞，然后在4 ℃下用一抗(caspase3,GAPDH,PAK4)孵育過夜，然后在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育1 h。采用增強化學發(fā)光法對蛋白帶進行檢測。

1.2.4熒光素酶報告系統(tǒng) 使用miRDB在線預測miR-193a-3p靶基因。初步鑒定出目標基因P21活化激酶4(PAK4)。從人cDNA文庫中擴增出PAK4 3′UTR的野生型序列。miR-193a-3p結合位點的突變是通過快速突變試劑盒定點突變引入的。PCR產物被克隆到pMir-Glo載體上，該載體位于限制位點XhoI和NotI之間的螢火蟲熒光素酶編碼區(qū)下游。通過雙熒光素酶報告基因試劑盒進行熒光素酶活性的檢測。

1.2.5細胞凋亡檢測實驗(Annexin V-FITC/PI雙染色法) 轉染24 h后，利用胰蛋白酶消化收獲細胞，用預冷卻的PBS洗滌并在-20 ℃下用70%乙醇溶液固定過夜。將胃癌細胞BGC-803洗滌兩次，在黑暗中37 ℃下重懸于含有0.1 mg/mL RNase A和0.1%Triton X-100的PBS中30 min。根據(jù)制造商的方案，使用凋亡檢測試劑盒，用膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-熒光素異硫氰酸酯(FITC)和碘化丙啶(PI)對總共1×106個細胞進行雙染色并通過熒光顯微鏡觀察。將實驗組中凋亡細胞的百分比與對照轉染組進行比較。所有樣品均進行3次重復試驗。

2 結 果

2.1miR-193a-3p在胃癌細胞中低表達 健康人胃黏膜細胞系GES-1、人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803、SNU16的RNA被提取后，通過實時熒光定量PCR結果發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p在健康人胃黏膜細胞系GES-1中高表達(P<0.05)，而在人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803、SNU16中低表達(P<0.05)，并且MGC-803細胞的表達量最低，見圖1。

注：與人胃黏膜細胞系GES-1中miR-193a-3p表達量相比，*P<0.05。

2.2miR-193a-3p靶向PAK4的3端非編碼區(qū) 通過TargetScan在線分析，發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p與PAK4的3端非編碼區(qū)存在互補區(qū)域。通過熒光素酶報告系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)miR-193a-3p靶向PAK4的3端非編碼區(qū)(P<0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3過表達miR-193a-3p細胞變化情況 轉染miR-193a-3p類似物后，胃癌細胞MGC-803中的miR-193a-3p水平上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3A。并且，免疫蛋白印跡發(fā)現(xiàn)PAK4的表達量降低，而凋亡標志蛋白cleaved-caspase3表達量升高，見圖3B。同時，胃癌細胞MGC-803的凋亡水平上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3C。

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.4敲低miR-193a-3p后細胞變化情況 轉染miR-193a-3p抑制劑后，胃癌細胞MGC-803中的miR-193a-3p水平下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4A。并且，免疫印跡結果顯示PAK4的表達量升高，而凋亡標志蛋白cleaved-caspase3表達量降低，見圖4B。同時，胃癌細胞MGC-803的凋亡水平下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4C。

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討 論

胃癌是全球范圍內與癌癥相關死亡的主要原因之一。盡管胃癌的手術和輔助治療技術不斷發(fā)展，但5年總生存率仍然很低，僅為30%[6]。胃癌的發(fā)病受到多因素的影響，包括遺傳易感性和環(huán)境因素。胃癌也會發(fā)生一系列的基因改變，包括抑癌基因、癌基因、細胞黏附分子和生長因子[7]。為了增加治愈率或改善胃癌患者預后，明確疾病特有的額外基因和途徑是至關重要的。

miRNA是一種內源性非編碼調控rRNA，其核苷酸長度為17～25 bp，在轉錄后基因調控中發(fā)揮重要作用[8]。可在各種靶mRNA的3端非編碼區(qū)同互補序列結合將導致mRNA直接降解或抑制翻譯。miRNA調節(jié)基因表達，促進發(fā)育、分化、炎癥和癌變。越來越多的證據(jù)表明，miRNA在癌組織和正常組織中的表達存在差異[9]。由于miRNAs在不同類型的組織甚至組織內的細胞類型都具有特異性，有研究對不同癌癥類型的miRNA進行了分析，從而提出了miRNAs在臨床應用中的診斷和預后價值[10]。在本研究中，相比于健康人胃黏膜細胞系GES-1，miR-193a-3p在人胃癌細胞系MKN-45、SGC-7901、MGC-803、SNU16中低表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且MGC-803的表達量最低。

miR-193a-3p靶向PAK4的3端非編碼區(qū)。miR-193a位于17號染色體上[11]。在加工過程中，發(fā)夾前體miRNA被裂解為成熟的miR-193a-3p和miR-193a-5p。有報道顯示，miR-193a-3p在多種癌癥中下調，包括乳腺癌、甲狀腺髓樣癌、非小細胞肺癌和鱗狀細胞肺癌[12]。在一些癌癥類型中，miR-193a的DNA位點的高甲基化與該miRNA的表達降低有關，如白血病、口腔癌和非小細胞肺癌[13]。因此，miR-193a-3p在相關癌癥中的下調發(fā)生在轉錄前，miR-193a很可能位于CpG島。

PAK家族成員最初被確定為Rac家族小型鳥苷三磷酸酶1(Rac1)和細胞周期蛋白42(Cdc42)的分子靶點[14]。目前，在哺乳動物細胞中已經發(fā)現(xiàn)了PAK家族的4個主要成員。PAK4最初是根據(jù)其作為細胞骨架調節(jié)蛋白的作用被識別的[15]。它是PAK家族中第一個被證明與Cdc42和絲狀偽足形成有關的成員。據(jù)報道，PAK1通過一種獨立于其結合Rac1的能力和部分獨立于其激酶活性的機制來誘導絲狀足和膜皺褶[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-193a-3p后，PAK4的表達量降低，而凋亡標志蛋白cleaved-caspase3表達量升高，胃癌細胞MGC-803的凋亡水平上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。敲低miR-193a-3p后，PAK4的表達量升高，而凋亡標志蛋白cleaved-caspase3表達量降低，胃癌細胞MGC-803的凋亡水平下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。近年來，雖然不同的PAKs具有不同的功能，但也被證明均在調節(jié)凋亡反應方面具有重要的作用，例如PAK4可以促使caspase3發(fā)生切割，激活了細胞凋亡標志蛋白caspase3，進而有助于細胞凋亡過程中發(fā)生形態(tài)和膜的變化[17]。

4 結 論

綜上所述，miR-193a-3p通過靶向調節(jié)PAK4促進胃癌細胞發(fā)生細胞凋亡。