李潔，劉子菡，董凡，王喻淇，王少平，代龍，張加余*，盧建秋

1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.濱州醫(yī)學院 藥學院，山東 煙臺 264003；3.北京中醫(yī)藥大學 圖書館，北京 100029

綠原酸(chlorogenic acids，CGAs)是天然抗氧化劑，也是藥食同源中藥中最豐富的多酚之一[1]。綠原酸類化學成分是眾所周知的抗菌消炎活性成分。此外，該類成分還具有保護DNA[2]、抗?jié)僛3]、降低膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白[4-5]等作用。其中，綠原酸(5-O-咖啡?？崴?是由咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸[6]，又名咖啡鞣酸和咖啡單寧酸。由于咖啡?；c奎尼酸結合位點的不同，綠原酸還有新綠原酸(3-O-咖啡?？崴?和隱綠原酸(4-O-咖啡?？崴?等重要的同分異構體。

綠原酸類在金銀花、菊花、茵陳、忍冬、杜仲等藥用植物中含量較高，并憑借顯著的抗炎效果成為《中華人民共和國藥典》中對中藥進行質量控制的指標。然而，綠原酸在高溫、強光下不穩(wěn)定，在中性及堿性條件下容易水解為新綠原酸、隱綠原酸[7]。因此，異構體之間的相互轉化直接影響到藥品質量，從而影響到臨床療效。藥物進入人體后，吸收和代謝是藥物體內代謝過程的重要步驟，與藥理活性密切相關。目前綠原酸的體內代謝過程研究較為深入，但其位置異構體新綠原酸的研究尚未開展，體內代謝產物尚不明確。因此，新綠原酸的體內代謝過程亟需進一步研究。

超高效液相色譜結合四極桿飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF MS)技術具有優(yōu)秀的色譜重現性以及超高的靈敏度和選擇性，可作為中藥復雜體系的快速分析平臺，并在代謝物鑒定中顯示出優(yōu)異的性能[8-10]。本文基于UPLC-Q-TOF MS篩選鑒定了新綠原酸的體內代謝產物，并闡明其主要的體內代謝通路，以期為綠原酸類成分的新藥研發(fā)及藥材、制劑的全面質量控制奠定基礎。

1 材料

Exion LCTMAC液相色譜儀與X500R QTOF質譜，配有雙噴霧Turbo V離子源，SCIEX OS 1.3工作站(AB SCIEX公司)；R200D型電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)；KQ-250 DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Eppendorf Centrifuge 5424 R離心機(德國);SPE Cartridges C18固相萃取小柱[500 mg·(3 mL)-1]。

新綠原酸(批號：PRF8050442)、隱綠原酸(批號：PRF8010501)、咖啡酸(批號：PRF7102044)、奎尼酸(批號：PRF8060823)均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，綠原酸(批號：110753-200413)、阿魏酸(批號：110773-201313)購于中國食品藥品檢定研究院，異阿魏酸(批號：MUST-14110611)購自成都曼思特生物科技有限公司，所有對照品純度均大于98%；乙腈和甲醇(質譜級，美國Thermo Fisher 公司)；甲酸(色譜級，德國Merck公司)。

Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，體質量(200±10) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

分別取上述7種對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成質量濃度約100 μg·mL-1的儲備液，用時稀釋成質量濃度適宜的對照品溶液。

2.2 生物樣品的制備

2.2.1對照品給藥液的配制 稱取新綠原酸180 mg，加入8 mL 0.9%氯化鈉溶液，超聲至充分混懸，配制成給藥溶液，于4 ℃儲存。

將8只SD大鼠隨機平均分為空白組和給藥組。實驗前，2組大鼠在動物房內進行適應性飼養(yǎng)1周(室溫22～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h晝夜更替)，給藥前禁食12 h，全程不禁水。給藥組按200 mg·kg-1的劑量給予0.9%氯化鈉溶液混懸液，而空白組的每只大鼠灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。各組均連續(xù)給藥2 d。

2.2.2血漿樣本的收集與儲存 大鼠在最后一次給藥后0.5、1、2、4 h，分別眼眶靜脈取血0.5 mL。所采集的血樣置于涂肝素鈉的離心管中靜置15 min，3500 r·min-1離心10 min(離心半徑為5.5 cm)，合并上述4個時間點的血液。分別吸取上清液，即得空白血漿和含藥血漿，于-80 ℃冰箱凍存。

2.2.3尿樣和糞樣的收集與儲存 灌胃給藥后0～24 h內，每隔6 h收集1次尿液和糞便，分別合并。尿樣3500 r·min-1離心10 min，后取上清液于-80 ℃冰箱凍存。糞樣置于通風櫥中晾干后碾碎，裝于離心管中凍存。

2.3 大鼠生物樣品的前處理

將2組凍存的血漿、尿液生物樣本放到室溫下解凍。取固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL水對其進行活化，然后分別吸取生物樣品2 mL上樣，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。

取各組糞樣適量，按照1∶5(W∶V)比例加入去離子水，超聲處理60 min，3500 r·min-1離心10 min，取上清液。取各組處理好的上清液置于固相萃取小柱，用3 mL水沖洗雜質，最后用3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液。

將上述所有甲醇洗脫液，在室溫下用氮氣吹干，殘渣用100 μL的初始流動相復溶，渦旋振蕩3 min后，14 000 r·min-1離心15 min(離心半徑為5.5 cm)。取上清液進行分析。

2.4 液質聯用分析條件

2.4.1色譜條件 色譜柱：Waters HSS T3 UPLC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相：0.1%甲酸水溶液(B)和乙腈(A)，進樣室溫度：15 ℃，柱溫：40 ℃，洗脫梯度(0～6 min，2%～10%A；6～10 min，10%～25%A；10～15 min，25%～35%A；15～16 min，35%～40%A；16～20 min，40%～80%A；20～21 min，80%～95%A；21～24 min，95%A)，體積流量：0.3 mL·min-1，進樣量：5 μL。

2.4.2質譜條件 HESI負離子模式，離子源溫度：550 ℃，電離源電壓：4.5 kV，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，掃描模式：Full MS/dd-MS2；數據依賴性ddMS2采集，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，高分辨掃描范圍m/z100～1000，碰撞能為30 eV。

2.5 高分辨質譜數據的預處理

藥物的代謝產物通常具有相同或者相似的母核結構。基于此，可采用數據采集的質量虧損過濾(MDF)軟件進行篩選追蹤主要的代謝物，尤其是不可預知的代謝產物。基于母藥新綠原酸的化學結構，設置了如下MDF模板：1)母藥(m/z353.086 71)及其核心結構咖啡酸和奎寧酸(m/z179.035 02、m/z191.055 04)；2)GSH結合產物(m/z660.171 51)，糖基化產物(m/z515.140 43)，葡萄糖醛酸結合產物(m/z529.119 90)和磺酸化產物(m/z433.043 53)等。另外，MDF窗口設置為±50 mDa。

所有數據采集和處理均在SCIEX OS 1.3.1工作站進行。根據精確分子質量，元素組成和可能發(fā)生的反應，對所有的母離子和碎片離子的分子式進行預測。相關參數設置為：C[0-30]，H[0-50]，O[0-30]，S[0-2]，N[0-3]，環(huán)不飽和雙鍵數(RDB equivalent value)[0-15]，質量精度誤差在1×10-5以內。

3 結果與討論

3.1 新綠原酸的質譜裂解規(guī)律分析

對新綠原酸對照品在負離子模式下的碎片離子進行系統分析，總結得到相關的特征離子。在負離子模式下，新綠原酸的準分子離子峰為[M-H]-m/z353.087 40(1.83×10-6，C16H17O9)，在質譜裂解過程中，其先丟掉1分子咖啡?；?，產生特征碎片離子m/z191.055 04(1.10×10-6，C7H11O6)，該離子繼續(xù)丟失1分子水產生m/z173.045 46(0.26×10-6，C9H7O4)。與此同時，還檢測到特征碎片咖啡酸離子m/z179.035 02，另外此離子分別丟失1分子水和1分子CO2形成碎片離子m/z161.022 4和m/z135.045 22。可能的裂解規(guī)律見圖1。

3.2 大鼠體內代謝產物的分析鑒定

通過對給藥組生物樣品與空白組樣品的比較分析，結合在線MDF數據處理軟件對新綠原酸代謝產物進行相對準確地篩查、鑒定，最終在大鼠的尿液、血漿和糞便樣品中共篩選鑒定了43個代謝產物。其中在血、尿和糞中分別鑒定了20、30、11個，具體的質譜信息見表1。代謝產物的鑒定結果分析如下。

圖1 負離子模式下新綠原酸對照品的質譜裂解圖

表1 大鼠生物樣品中新綠原酸代謝產物的質譜信息

續(xù)表1

在負離子模式下，代謝物M10、M20、M17產生相同的準分子離子峰m/z353.086 71[M-H]-，推測其分子式為C16H17O9(誤差≤±2.00×10-6)。在其ESI-MS2譜圖中，它們均產生碎片離子m/z179.035 02(咖啡酸骨架離子)以及奎尼酸負離子碎片m/z191.055 04。其中，M10和M20的色譜保留時間與質譜裂解信息與新綠原酸、綠原酸相同，因此將兩者分別準確鑒定為新綠原酸和綠原酸，并將M17推斷為其同分異構體。

代謝物M39、M25、M26的相對保留時間分別為10.79、9.17、9.23 min。它們的準分子離子峰為m/z179.035 26[M-H]-，推斷最可能的分子式為C9H7O4(誤差≤±2.00×10-6)。在其ESI-MS2譜中，觀察到碎片離子m/z135[M-H-CO2]-，表明它們的分子中存在羧基。另外，根據與咖啡酸對照品的保留時間以及質譜裂解行為比對，可將M25準確鑒定為咖啡酸，結合參考文獻[11]報道將M39和M26推斷為咖啡酸異構體。

代謝物M9、M16具有相同的準分子離子峰m/z181.049 53[M-H]-，比咖啡酸多2。根據精確相對分子質量推測其分子式為C9H9O4，相對誤差均小于2×10-6。在ESI-MS2譜中，m/z181丟失1分子H2O(18 Da)產生了主要的碎片離子m/z163，并且可中性丟失1分子CO2(44 Da)形成碎片離子m/z137。結合參考文獻[12]報道將兩者鑒定為咖啡酸的氫化產物。

M6的準分子離子峰為m/z236.057 07[M-H]-，可知其分子式為C11H10NO5，誤差為1.73×10-6。在其ESI-MS2譜圖中，m/z236通過中性丟失C2H4NO2和C3H4NO3，生成碎片離子m/z162[M-H-NH2CH2COO]-和m/z134[M-H-C2H4NO2-CO]-，由此推測分子中有甘氨酸和羰基的存在。參照文獻[13]報道，可將代謝產物M6鑒定為咖啡酸的甘氨酸結合產物。

代謝物M43在14.15 min被洗脫，其準分子離子峰為m/z357.078 55[M-H]-，推測其分子式為C15H17O10，誤差<2×10-6。在ESI-MS2譜圖中，m/z357通過中性丟失1分子CO2形成碎片離子m/z313。此外，還觀察到碎片離子m/z181[M-H-glucuronide-H2O]-，推測葡萄糖醛酸結合反應發(fā)生。結合文獻[14]報道，M43被鑒定為二氫咖啡酸的葡萄糖醛酸結合產物。

代謝物M4在準分子離子峰在m/z147.045 43[M-H]-，推測其相對分子式為C9H7O2(誤差0.03×10-6)。在其ESI-MS2光譜中，m/z147通過中性丟失1分子CO2生成碎片離子m/z103[M-H-CO2]-。此外，它的相對分子質量比咖啡酸少32 Da。結合文獻[15]報道以及相關的生物轉化規(guī)律，將M4鑒定為肉桂酸。

M28的準分子離子峰為m/z163.040 30[M-H]-，根據精確相對分子質量推測其分子式為C9H7O3。M28的相對分子質量比咖啡酸少16 Da，并產生碎片離子m/z119[M-H-CO2]-，表明有羧酸基團的存在。因此，將M28鑒定為咖啡酸的脫羥基產物香豆酸。

M8、M14、M11、M15有相同的準分子離子峰m/z261.006 35[M-H]-，推測其分子式為C9H9O7S，所有質量誤差均小于2×10-6。在ESI-MS2譜圖中，由于中性損失1分子SO3和1分子CO2，分別產生碎片離子m/z181[M-H-SO3]-和m/z137[M-H-SO3-CO2]-，說明它們的分子結構中存在羧基和磺酸基。結合相關文獻[14]報道，它們被鑒定為二氫咖啡酸磺酸化結合物。

代謝物M23的保留時間為9.08 min，準分子離子峰為m/z273.007 40[M-H]-，其分子式為C10H9O7S(質量誤差0.20×10-6)。在ESI-MS2譜圖中，由于中性丟失SO3、CO2和CH3，分別產生碎片離子m/z193[M-H-SO3]-、m/z149[M-H-SO3-CO2]-和m/z134[M-H-SO3-CO2-CH3]-，表明分子結構中存在羧酸基團、硫酸基團以及甲基。基于上述推論和相關的生物轉化反應，M23被鑒定為甲基化咖啡酸的磺酸化產物。

M35的準分子離子峰為m/z135.044 06[M-H]-，保留時間為10.24 min。此外，分子式為C8H7O2(質量誤差1.34×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，由于中性丟失1分子CH3，從而觀察到二級碎片離子m/z120[M-H-CH3]-。根據相關的生物轉化規(guī)律，將M35鑒定為咖啡酸脫羧產物。

代謝物M19、M30、M41的保留時間為8.64、9.41、11.05 min，準分子離子峰為m/z193.049 53[M-H]-。根據精確相對分子質量推測其分子式為C10H9O4(質量誤差均在2.00×10-6以內)。在ESI-MS2圖譜中，由于中性丟失1分子CO2和1分子CH3產生碎片離子m/z178[M-H-CH3]-、m/z149[M-H-CO2]-和m/z134[M-H-CO2-CH3]-，表明分子中存在羧基和甲基。通過與對照品的質譜碎片離子信息和色譜保留時間比較，M41被準確鑒定為阿魏酸，M30被準確鑒定為異阿魏酸，M19推斷為其同分異構體。

M22、M38的色譜保留時間分別為9.01、10.72 min，準分子離子峰分別為m/z165.055 89和m/z165.055 85，根據精確相對分子量可知分子式組成為C9H9O4(誤差分別為1.29×10-6和1.25×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，兩者均通過丟失1分子CO2在m/z121[M-H-CO2]-處形成產物離子，這表明其分子中存在羰基。根據先前報道的文獻[16]，M22和M38被鑒定為對羥基苯丙酸或其異構體。

代謝物M1的準分子離子峰為m/z191.056 14[M-H]-，保留時間為0.93 min，分子式為C7H11O6(質量誤差1.13×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子水和1分子CO2產生碎片離子m/z173[M-H-H2O]-和m/z147[M-H-CO2]-。此外，中性丟失2分子水和1分子CO2產生碎片離子m/z111[M-H-CO2-2H2O]-。據此推斷分子中極有可能存在至少2個羥基和1個羧基。M1與奎尼酸對照品的色譜保留時間和質譜碎片相同，因此結合參考文獻[17]將代謝物M1準確鑒定為為奎尼酸。

代謝物M2準分子離子峰為m/z173.045 72[M-H]-，基于精確分子質量可知其分子式為C7H9O5(誤差≤±2.00×10-6)。其分子離子比奎尼酸少18 Da，推測它極有可能是奎尼酸的脫羥基產物。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO2產生碎片離子m/z129[M-H-CO2]-，另外中性丟失1分子H2O產生碎片離子m/z155[M-H-H2O]-，這表明分子中存在羥基和羧基。結合相關的文獻[11]報道，將代謝產物M2鑒定為莽草酸。

代謝物M27的準分子離子峰為m/z121.029 85[M-H]-，分子式為C7H5O2(誤差為1.45×10-6)。此外，它通過丟失1分子CO產生碎片離子m/z93[M-H-CO]-，這表明該化合物中存在羰基。根據先前報道的文獻[18]，代謝產物M27被鑒定為苯甲酸。

代謝物M12準分子離子峰為m/z137.024 59[M-H]-。分子式為C7H5O3(誤差為1.27×10-6)，其分子離子比苯甲酸多16 Da，推測可能是苯甲酸的羥基化產物。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO2和1分子H2O分別產生碎片離子m/z93[M-H-CO2]-和m/z109[M-H-H2O]-，表明該化合物中存在羥基和羰基。根據先前報道的文獻[19]，將代謝物M12鑒定為3-羥基苯甲酸。

代謝物M18準分子離子峰在m/z178.051 07[M-H]-，基于精確分子質量、同位素豐度比可知其分子式為C9H8NO3(誤差1.21×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，通過中性丟失1分子CO2產生二級碎片離子m/z134[M-H-CO2]-，這表明分子中有羧酸基團的存在。因此，將其鑒定為馬尿酸。

代謝物M13在7.77 min時洗脫，準分子離子峰為m/z194.046 43[M-H]-。其分子式為C8H8NO4(誤差1.63×10-6)。另外，它的分子離子比馬尿酸多16 Da。此外，通過中性丟失1分子CO2和1分子CH3生成碎片離子m/z135[M-H-CO2-CH3]-和m/z150[M-H-CO2]-，表明分子中存在羧基和甲基。因此，結合參考文獻[19]將其鑒定為3-羥基馬尿酸。

代謝物M3、M7色譜保留時間分別為4.7、6.15 min。它們的準分子離子峰為m/z197.044 45[M-H]-，分子式組成為C9H9O5(誤差≤±2.00×10-6)。在ESI-MS2圖譜中，通過丟失1分子OCH2、1分子H2O和1分子CO2生成碎片離子m/z167[M-H-OCH2]-，m/z149[M-OCH3-H2O]-和m/z121[M-OCH3-H2O-CO]-，表明分子中存在甲氧基、羰基以及羥基。結合相關的生物轉化知識，代謝物M3、M7鑒定為丁香酸或其異構體。

代謝物M5色譜保留時間為5.33 min。在其ESI-MS譜圖中，準分子離子峰m/z167.034 97[M-H]-(分子式為C8H7O4，誤差1.09×10-6)。在其ESI-MS2譜圖中，通過中性丟失1分子CO2(44 Da)和1分子H2O(18 Da)產生碎片離子m/z123[M-H-CO2]-和m/z149[M-H-H2O]-，這表明分子中存在羧基和羥基。結合相關的文獻報道將其鑒定為香草酸。

在ESI-MS譜圖中，代謝物M40的準分子離子峰為m/z355.097 23[M-H]-(C16H19O9，誤差-5.13×10-6)，色譜保留時間為11.04 min。其分子式比原型藥物多2H，推測它是新綠原酸的氫化產物。除此之外，在其ESI-MS2譜圖中，觀察到二級碎片m/z173[奎尼酸-H2O-H]-和m/z181[二氫咖啡酸-H]-和m/z137[二氫咖啡酸-CO2-H]-。因此，代謝物M40鑒定為二氫新綠原酸。

在C17H19O9提取離子流圖中，可以檢測到4個準分子離子峰M21、M29、M34、M37(誤差均 ≤± 2.00×10-6)，色譜保留時間為8.92～10.42 min。它們分子式比原藥新綠原酸多CH2。在其ESI-MS2譜圖中，它們都具有相同的產物離子m/z134.045 22。此外，還存在碎片離子m/z191.055 04[奎尼酸-H]-和m/z173.045 72[奎寧酸-H2O-H]-。綜上分析，它們具有與原藥相同的特征離子并且比原藥分子離子多14 Da，因此將其鑒定為新綠原酸的甲基化產物。

M24、M31、M32、M33、M36有相同的準分子離子峰為m/z369.118 01[M-H]-(C17H21O9，誤差≤± 2.00×10-6)。它們分子式比原藥的甲基化產物多2 H。在其ESI-MS2光譜中，它們具有與原藥相同的特征離子m/z191[奎尼酸-H]-，m/z173[奎尼酸-H2O-H]-，據此推斷它們是甲基化綠原酸的氫化產物。

代謝物M42保留時間為13.82 min，準分子離子峰為m/z543.170 83[M-H]-(C24H31O14)。在其ESI-MS2譜圖中，通過丟失176 Da產生碎片離子m/z367[M-H-C7H12O5]-，這表明其分子中含有葡萄糖醛酸。且m/z367比原藥分子式多CH2，結合二級碎片離子m/z173[奎寧酸-H2O-H]-和m/z135[咖啡酸-CO2-H]-。表明有奎尼酸骨架、咖啡酸骨架存在。因此，M42被鑒定為甲基新綠原酸的葡萄糖結合產物。

3.3 大鼠體內新綠原酸的代謝途徑分析

新綠原酸進入大鼠體內后發(fā)生了廣泛的代謝反應[20-22]。結合代謝產物分析新綠原酸在體內的代謝過程及轉化，結果見圖2，其在體內主要發(fā)生的反應有3種。1)異構化：在新綠原酸給藥后的生物樣品中發(fā)現了綠原酸和其異構體，說明新綠原酸在體內進行了位置異構等反應。2)分解反應：新綠原酸進入體內后可以水解為咖啡酸和奎尼酸2個核心代謝產物，并在此基礎上發(fā)生進一步的二次代謝反應?？崴峤涹w內代謝轉化為莽草酸，經2次脫羥基后生成羥基苯甲酸，再脫羥基變?yōu)楸郊姿幔涍^與甘氨酸結合后生成馬尿酸，最后馬尿酸羥基化反應生成3-羥基馬尿酸；奎尼酸也可以直接轉化為丁香酸，而后脫去甲氧基和羥基生成香草酸。而咖啡酸也發(fā)生多種反應。例如，甲基化生成阿魏酸或異阿魏酸；還原反應生成二氫咖啡，并在此基礎上進行硫酸酯化生成二氫咖啡酸硫酸酯結合物或者二氫咖啡酸葡萄糖醛酸化生成二氫咖啡酸葡萄糖醛酸結合物；咖啡酸還發(fā)生了分解反應，比如脫羧反應，再者脫羥基后生成香豆酸而后繼續(xù)脫羥基生成肉桂酸等。3)其他反應：首先新綠原酸容易還原生成二氫新綠原酸；其次甲基化反應，新綠原酸在咖啡酸側鏈上發(fā)生甲基化反應；最后，新綠原酸能夠在側鏈上連接葡萄糖醛酸發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應。

4 結論

本研究利用UPLC-Q-TOF MS高分辨液質聯用技術分析鑒定了新綠原酸在大鼠的血漿、尿液和糞便樣品中的代謝產物。通過分析這些代謝產物的精確相對分子質量、特征碎片離子以及色譜保留行為等，共篩選鑒定出包括新綠原酸原型在內的43個代謝產物。同時，本研究還推測了新綠原酸的體內代謝途徑，初步闡釋了其發(fā)揮藥效的物質基礎輪廓。新綠原酸的體內代謝產物主要有咖啡酸、阿魏酸、異阿魏酸、莽草酸、香草酸等，它們均具有很好的抗菌、抗氧化作用，這為闡明新綠原酸發(fā)揮抗菌、抗炎等藥理活性提供了一定依據。上述研究結果也為含有綠原酸類物質的中藥及食品的體內代謝研究提供了借鑒，尤其對藥效物質基礎的研究具有重要參考意義。

圖2 新綠原酸在大鼠體內的代謝途徑