許麗婷 徐彬人 盛蒙 吳瓊 王文佳 田維毅 俞琦

【摘?要】?目的：觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）表達(dá)及膽固醇含量的影響，探討黃連解毒湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的可能作用機(jī)制。方法：SD大鼠給予大、中、小劑量黃連解毒湯灌胃后制備含藥血清。用氧化低密度脂蛋白（ox -LDL）誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞分化為泡沫細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白組、模型組、黃連解毒湯含藥血清大劑量組、中劑量組、小劑量組，每組1.5×106個(gè)細(xì)胞，分別加入無(wú)血清培養(yǎng)液和不同濃度含藥血清干預(yù)24h，總膽固醇及游離膽固醇試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中膽固醇含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清各劑量組泡沫細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）含量明顯降低（P<0.05或P<0.01），大劑量組游離膽固醇（FC）含量顯著下降（P<0.01）;含藥血清各劑量組ABCA1 mRNA表達(dá)均明顯升高（ P<0.05）。結(jié)論：黃連解毒湯上調(diào)泡沫細(xì)胞ABCA1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出，可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】?黃連解毒湯;泡沫細(xì)胞;ABCA1;膽固醇;動(dòng)脈粥樣硬化

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）6-0010-04

Abstract：Objective To observe the effect of serum containing Huanglian Jiedu Decoction on the expression of ATP-binding cassette transporter（ABCA1） and cholesterol content in foam cells.To explore the possible mechanism of action of Huanglian Jiedu Decoction against atherosclerosis. Methods SD rats were given Large， medium and small doses of Huanglian Jiedu Decoction to prepare drug-containing serum. RAW264.7 macrophages were induced to differentiate into foam cells by oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）. The cells were divided into control group， model group， Huanglian Jiedu Decoction-containing serum high-dose group， medium-dose group， and low-dose group. 1.5×106 cells in each group were added to serum-free medium and different concentrations of drug-containing serum for 24h. The total cholesterol（TC） and free cholesterol（FC） kits were used to detect the cholesterol content in the cells， and the expression of ABCA1 mRNA was detected by quantitative real-time PCR.Result Compared with the model group， TC content in the foam cells of Huanglian Jiedu Decoction group was significantly decreased （P<0.01）， and the FC content in the high dose group was significantly decreased （P<0.01）. The expression of ABCA1 mRNA in serum dose group was significantly increased （P<0.05）.Conclusion Huanglian Jiedu Decoction up-regulates the transcription and expression of foam cell ABCA1 and promotes cholesterol efflux， which may be one of the mechanisms of its anti-atherosclerosis.

Key?words：Huanglian Jiedu Decoction; foam cells; ABCA1; cholesterol; atherosclerosis

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥物組成，是清熱解毒最具代表的方藥之一，具有瀉火解毒功效，主治熱毒充斥三焦之證。其臨床應(yīng)用非常廣泛，對(duì)Ⅱ型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年性癡呆等病癥有明顯療效[1-3]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，黃連解毒湯可通過(guò)抗炎、降血脂、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[4]。但其對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的影響及作用機(jī)制尚不明確。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）是調(diào)控細(xì)胞膽固醇流出的有效途徑，其表達(dá)不足將導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)沉積大量的膽固醇，加重動(dòng)脈粥樣硬化病變。本研究擬采用黃連解毒湯含藥血清干預(yù)泡沫細(xì)胞，觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1蛋白及膽固醇含量的影響，探討黃連解毒湯是否通過(guò)調(diào)節(jié)ABCA1蛋白表達(dá)及泡沫細(xì)胞膽固醇流出而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1?材料

1.1?細(xì)胞株?小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞，購(gòu)自上海中僑新舟。

1.2?藥物與試劑?黃連、黃芩、黃柏、梔子購(gòu)自同仁堂貴陽(yáng)藥店，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為正品。胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），DMEM和青鏈霉素混合液（美國(guó)Gibco公司），氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，廣州奕源生物），總膽固醇及游離膽固醇檢測(cè)試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。ABCA1和β-actin引物（上海生工生物工程）。

1.3?動(dòng)物?健康SD大鼠24只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷(xiāo)售有限公司，許可證號(hào)： SCXK-（ 軍） 2012-0011。

1.4?主要儀器?SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）;PCR 儀（美國(guó)ABI Applied Biosystems）;ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

2?方法

2.1?制備黃連解毒湯含藥血清?上述藥材按傳統(tǒng)方法進(jìn)行水煎煮，煎煮兩次，合并兩次濾液，即得黃連解毒湯水煎劑。調(diào)整濃度為相當(dāng)于生藥2g/mL，置4℃冰箱備用。SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，黃連解毒湯大、中、小劑量組，每組6只。大、中、小劑量組分別以6、3、1.5g生藥/kg灌胃給藥，體積為1mL/100g（大鼠體重）;正常組給予等體積蒸餾水。2 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后股動(dòng)脈采血，常規(guī)制備血清，56℃ 30min 滅活補(bǔ)體，0.22μm過(guò)濾除菌，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2?細(xì)胞培養(yǎng)及分組?細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10 %胎牛血清和1 %雙抗（青霉素+鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以2×105個(gè)/m L的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，用ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[5]。細(xì)胞分為：空白組、模型組（培養(yǎng)液+80μg/mL ox-LDL）和黃連解毒湯大、中、小劑量組（20%黃連解毒湯含藥血清大、中、小劑量+80μg/mL ox-LDL）。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24h。

2.3?泡沫細(xì)胞油紅O染色?用PBS液洗滌各組細(xì)胞，用50%異丙醇進(jìn)行固定，油紅O工作液染色15min后沖洗5min;蘇木精染色10min，沖洗，氨水返藍(lán)后顯微鏡下觀察，紅色顆粒為蓄積的脂質(zhì)。

2.4?泡沫細(xì)胞中膽固醇含量的測(cè)定?裂解各組細(xì)胞，收集裂解細(xì)胞上清液，測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）和游離膽固醇（FC）的含量。具體按膽固醇檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2.5?RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá)?收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA后，紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA 的濃度以及純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，PCR條件： 95℃預(yù)變性 30s，95 ℃ 5 s、60℃ 40s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。ABCA1引物序列為：上游：5′-TAC CAG CAT TAA GGA CAT GCA C-3′;下游：5′-TTT GAT CCG TTA CAC AGA CTG G-3′。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析RNA，分析各組目的基因的灰度值，以目的基因與β-actin基因的比值代表ABCA1 mRNA的表達(dá)。

2.6?統(tǒng)計(jì)分析?應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)意義。

3?結(jié)果

3.1?黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞的影響?油紅O染色顯示，空白組細(xì)胞無(wú)著色，模型對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈空泡樣，泡沫細(xì)胞中有大量脂質(zhì)蓄積。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴顯著減少，大劑量組細(xì)胞內(nèi)脂滴減少最明顯（見(jiàn)圖1）。

3.2?黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞中膽固醇含量的影響?與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組細(xì)胞TC含量明顯下降（P<0.05或P<0.01）;黃連解毒湯含藥血清大劑量組細(xì)胞FC含量顯著降低（P<0.01），小和中大劑量組無(wú)明顯差異（見(jiàn)表1）。

3.3?黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)水平的影響?如圖2所示，與模型組比較，在黃連解毒湯含藥血清的干預(yù)下，隨著劑量的增加，細(xì)胞的ABCA1 基因表達(dá)明顯升高（P<0.01）。

4?討論

動(dòng)脈粥樣硬化是引發(fā)心血管疾病的主要原因，可導(dǎo)致患病人群高死亡率。動(dòng)脈粥樣硬化是一種由斑塊堆積引起的動(dòng)脈內(nèi)部狹窄的疾病，其斑塊的主要成分是脂肪、膽固醇、鈣和血液中其他物質(zhì)。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，隨著胞內(nèi)的ox-LDL堆積、脂質(zhì)負(fù)載，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)為泡沫細(xì)胞。病理過(guò)程中泡沫細(xì)胞凋亡，將膽固醇釋放到血管中，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變[11] 。ABCA1是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，激活的ABCA1可促進(jìn)游離膽固醇和磷脂外流形成HDL顆粒，從而影響膽固醇從巨噬細(xì)胞的流出，因此在AS的發(fā)病機(jī)理中起重要作用[12]。中醫(yī)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化主要的三大病理因素是濕熱、毒邪和痰淤。黃連解毒湯具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主要用于治療三焦火毒熱盛的癥狀，可用于抵抗動(dòng)脈粥樣硬化的病變進(jìn)程[13]。本研究通過(guò)觀察黃連解毒湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞的作用效果，探討黃連解毒湯抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清組泡沫細(xì)胞的油紅O染色中脂滴顯著減少，且大劑量組脂滴減少最明顯，說(shuō)明黃連解毒湯減少泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴含量，且有劑量依賴(lài)性。與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯升高。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組細(xì)胞TC含量明顯下降;說(shuō)明黃連解毒湯可以下調(diào)泡沫細(xì)胞脂滴含量，并有劑量依賴(lài)性。黃連解毒湯含藥血清大劑量組細(xì)胞FC含量顯著降低，小和中大劑量組無(wú)明顯差異。說(shuō)明大劑量的黃連解毒湯可促進(jìn)FC外排。與模型組比較，在黃連解毒湯含藥血清的干預(yù)下，隨著劑量的增加，泡沫細(xì)胞的ABCA1 基因表達(dá)明顯升高，說(shuō)明黃連解毒湯可促進(jìn)ABCA1基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯上調(diào)泡沫細(xì)胞ABCA1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出，可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。ABCA1可能是其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一，這對(duì)臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化病變具有指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2019-12-24?編輯：劉斌）