常國(guó)蓉，李任建，張琦，張育銘，韓淵懷，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山西太谷 030801）

0 引言

【研究意義】脫落酸（ABA）作為一類“逆境激素”，在響應(yīng)干熱、高鹽、低溫、重金屬及輻射等非生物脅迫過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)，脫落酸可直接或通過(guò)與水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ETH）等激素的互作或調(diào)控等參與寄主的生物脅迫[1]。脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴其受體蛋白 PYR/PYL/PCAR及負(fù)調(diào)控因子2C類蛋白磷酸酶（PP2C）和正調(diào)控因子SNF1相關(guān)的蛋白激酶（SnRK2）組成的雙重負(fù)調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控，激活其下游基因的表達(dá)[2-3]。據(jù)報(bào)道，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等作物中，約 10%的基因受脫落酸的調(diào)控[3]。谷子（Setaria italica）是我國(guó)北方地區(qū)一種重要的雜糧作物，具有較強(qiáng)的抗旱、抗逆能力，且生育期短，經(jīng)濟(jì)效益高[4]。但谷子生產(chǎn)上常受到多種生物脅迫及非生物脅迫因素的影響，特別是近年來(lái)，隨著谷子種植規(guī)模擴(kuò)大，由卵菌綱禾生指梗霉（Sclerospora graminicola）引起的谷子白發(fā)病在各地頻發(fā)，對(duì)谷子產(chǎn)量和品質(zhì)的提高造成嚴(yán)重威脅，分析脫落酸在谷子響應(yīng)禾生指梗霉侵染中的調(diào)控作用，有利于解析谷子白發(fā)病的發(fā)生特點(diǎn)及規(guī)律，并為其防治提供新思路?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）在水稻感染部位能夠激活脫落酸信號(hào)，抑制水稻中最初入侵的免疫信號(hào)，從而負(fù)調(diào)控水稻對(duì)稻瘟病菌的抗病性[5-6]。SONG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)番茄葉面外施脫落酸，可有效降低番茄早疫病菌（Alternaria solani）對(duì)番茄植株的病害程度。ARF10可誘導(dǎo)甘藍(lán)型油菜對(duì)脫落酸的敏感性，提高對(duì)黑斑病菌（Alternaria brassicicola）的抗性[8]。PYL和SnRK2是脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中兩個(gè)關(guān)鍵的正反饋調(diào)節(jié)的家族基因。當(dāng)植物體內(nèi)脫落酸大量積累時(shí)，脫落酸與其受體PYR/PYLs/RCARs結(jié)合后，其以單體形式與磷酸酶PP2Cs結(jié)合，通過(guò)抑制PP2Cs，從而釋放SnRK2s蛋白激酶，SnRK2s磷酸化激活A(yù)BFs及RAV1等轉(zhuǎn)錄因子、激活下游脫落酸響應(yīng)基因[9-14]。反之當(dāng)脫落酸含量較低時(shí)，PYR/PYLs/RCARs以二聚體的形式存在，SnRK2的活性受到抑制，阻止脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)[15]。ZHANG等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SnRK2家族的OsSAPK9可與OsSGT1相互作用，提高水稻的抗白葉枯病能力；YAO等[17]通過(guò)GWAS群體和轉(zhuǎn)錄關(guān)聯(lián)的方法，鑒定到PYL和SnRK2在玉米早期抗穗腐病中顯著上調(diào)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】現(xiàn)有研究表明，脫落酸在寄主響應(yīng)病菌侵染、擴(kuò)展、致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]，且PYL和SnRK2是脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中兩類關(guān)鍵因子，在脫落酸代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而目前尚未有脫落酸代謝在谷子抗病中的相關(guān)研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)基因家族、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）、轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)PYL和SnRK2家族基因進(jìn)行鑒定和分析，探索谷子響應(yīng)禾生指梗霉侵染過(guò)程中脫落酸發(fā)揮的作用及關(guān)鍵的調(diào)控因子，為后續(xù)谷子抗白發(fā)病或抗其他生物脅迫的調(diào)控機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感病品種晉谷 21號(hào)種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所種質(zhì)資源庫(kù)提供，病菌孢子于2016年在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田的病株上分離獲得。2017年5月初將種子拌菌處理后種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子雜糧育種基地，以消毒不接種谷子為對(duì)照組，采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方法劃分試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為3 m×2 m。在谷子葉片剛表現(xiàn)出“灰背”癥狀后，每隔7 d取材一次，樣品經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存，用于脫落酸含量測(cè)定和RNA提取，共取材5次，以健康葉片為對(duì)照，3次重復(fù)。

1.2 谷子PYL和SnRK2家族全基因篩選

PYL家族篩選：在 Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中獲取谷子（v2.2）、水稻（v7_JGI）和擬南芥（TAIR10）的基因組數(shù)據(jù)。在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）中下載PYL（Polyketide_cyc2）HMMER模型（PF10604），通過(guò)HMMER軟件[18]中的hmmsearch命令搜索谷子全基因蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，選取比對(duì)值 E-value＜0.01。SnRK2家族篩選：利用蛋白激酶模型（PF00069）通過(guò)hmmsearch對(duì)谷子基因組進(jìn)行搜索，隨后利用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)和水稻數(shù)據(jù)庫(kù)下載的SnRK2家族基因?qū)ι弦徊骄哂械鞍准っ附Y(jié)構(gòu)的基因進(jìn)行同源比對(duì)，選取比對(duì)值E-value＜0.01，利用MEGA計(jì)算篩選的基因與水稻、擬南芥SnRK2的遺傳距離，篩選谷子SnRK2家族基因。

使用 Pfam中的 Batch search對(duì)檢索到PYL和SnRK2蛋白序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證。使用TBtools軟件[19]對(duì)谷子的基因組注釋gff3文件的基因定位結(jié)果可視化分析。

1.3 谷子PYL和SnRK2蛋白理化性質(zhì)和基因定位分析

采用在線工具 ExPASY-ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)谷子PYL和SnRK2家族基因的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)和總平均疏水指數(shù)進(jìn)行分析[20]。

1.4 谷子PYL和SnRK2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA 7.0[21]中的ClustalW將擬南芥（9個(gè)）、水稻（8個(gè)）的PYL序列與谷子PYL序列進(jìn)行多重比對(duì)，將擬南芥（5個(gè)）、水稻（9個(gè)）SnRK2序列與谷子SnRK2序列進(jìn)行多重比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，矯正后，通過(guò)Test Neighbor-Joining Tree（鄰近法）構(gòu)建進(jìn)化樹。利用進(jìn)化樹在線美化網(wǎng)站ITOL進(jìn)行進(jìn)化樹美化。

1.5 谷子PYL和SnRK2的順式作用元件分析

采用TBtools軟件[19]提取谷子PYL和SnRK2家族基因的啟動(dòng)子序列，將提取的啟動(dòng)子序列到在線數(shù)據(jù)庫(kù) PlantCARE（http://bioinformatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html）[22]分析谷子PYL和SnRK2家族基因順式作用元件。

1.6 脫落酸含量的測(cè)定

取0.5 g葉片材料在液氮中研磨成粉末，將粉末與3 mL 80%甲醇在4℃下混合4 h，4℃，12 000×g離心20 min。收集上清液，用作激素提取液[23]。采用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)）測(cè)定內(nèi)源激素脫落酸含量[24]。用酶標(biāo)儀（SP-Max2300A2）在450 nm處測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算待測(cè)激素的含量。以同時(shí)期健康葉片為對(duì)照，3次重復(fù)。

1.7 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模塊鑒定

利用同時(shí)期轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣，過(guò)濾 FPKM值＜1的基因。使用R軟件（R version 3.4.4）和WGCNA（R version 1.6.6）包，構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與劃分相關(guān)模塊[25]。使用 WGCNA包中的 pickSoftThreashold計(jì)算軟閾值，選取最佳網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的 power值。使用blockwiseModules構(gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)按照默認(rèn)值設(shè)置[25]。

1.8 脫落酸及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵模塊鑒定和功能分析

利用moduleTraitCor＜-cor（mergedMEs，datTraits，use=“p”）對(duì)脫落酸含量和共表達(dá)模塊進(jìn)行相關(guān)性分析，鑒定關(guān)鍵模塊。分析PYL和SnRK2基因家族在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的分布情況，鑒定其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的關(guān)鍵模塊。提取模塊中的基因，利用TBtools進(jìn)行GO富集[19]，以谷子基因組為參考數(shù)據(jù)庫(kù)，P-value＜0.05，利用Cytoscape對(duì)模塊進(jìn)行可視化[26]。

1.9 谷子PYL和SnRK2在禾生指梗霉脅迫下的表達(dá)模式分析

對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，利用pheatmap對(duì)谷子PYL和SnRK2家族成員的表達(dá)水平進(jìn)行可視化。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

選取4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用primer 3設(shè)計(jì)定量PCR引物，利用M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（TaKaRa）對(duì)提取的RNA進(jìn)行純化并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用2×SG快速qPCR混合試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行熒光定量分析。qRT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體積為15 μL，包括7.5 μL 2×SG快速qPCR主混合物、0.6 μL每個(gè)引物、40 ng cDNA模板、3.3 μL ddH2O。PCR流程：95℃變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，以actin為內(nèi)對(duì)照基因，用2-ΔΔCT法計(jì)算相關(guān)基因表達(dá)。3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 谷子PYL和SnRK2的篩選

基因家族分析共鑒定到PYL和SnRK2家族基因各11個(gè)（表1）。谷子PYL和SnRK2家族基因除6號(hào)和8號(hào)染色體外，其余染色體均有分布，其中4號(hào)染色體上只有PYL基因Seita.4G239500，2號(hào)和7號(hào)染色體上只有SnRK2，分別為 Seita.2G394500和 Seita.7G100500，3號(hào)和9號(hào)染色體上數(shù)目最多，分別有6個(gè)。PYL家族基因氨基酸長(zhǎng)度介于175—220 aa，等電點(diǎn)介于 4.39—8.88，分子量較小，分子量最大為23.67 kD。SnRK2家族基因氨基酸數(shù)目在333—454 aa，等電點(diǎn)介于 4.73—8.49，分子量較大，最高可達(dá)51.77 kD。

表1 谷子PYL和SnRK2基因家族成員基本信息Table 1 The basic information of PYL and SnRK2 gene family members in S.italica

2.2 谷子PYL和SnRK2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

谷子PYL家族在系統(tǒng)進(jìn)化中分為4類，橙色分支中的 Seita.3G072600、Seita.5G302400和 Seita.5G140800較為保守，藍(lán)色分支中的谷子PYL與水稻PYL聚集在一起，表明這部分谷子PYL可能與水稻PYL親緣性較高。谷子SnRK2家族在系統(tǒng)進(jìn)化中可分為3類，在灰色、紫色和黃色3個(gè)分支中，水稻SnRK2均與谷子SnRK2位于同一小分支上，而擬南芥SnRK2在分支上較獨(dú)立，表明SnRK2在禾本科間較為保守（圖1）。

2.3 順式作用元件預(yù)測(cè)

谷子PYL和SnRK2家族基因順式作用元件分析表明（圖2），PYL和SnRK2家族基因中在127個(gè)區(qū)域預(yù)測(cè)到光響應(yīng)元件。其中，22個(gè)家族基因都預(yù)測(cè)到脫落酸響應(yīng)元件；谷子PYL家族基因Seita.1G013900、Seita.9G311900和SnRK2家族基因Seita.3G230400和Seita.3G369900被預(yù)測(cè)到防御和脅迫響應(yīng)元件；PYL和SnRK2家族基因同時(shí)預(yù)測(cè)到其他激素類響應(yīng)元件，其中與茉莉酸甲酯響應(yīng)有關(guān)的基因最多，PYL家族9個(gè)，SnRK2家族10個(gè)。

2.4 脫落酸含量的測(cè)定

受侵染不同時(shí)期葉片中脫落酸含量測(cè)定表明，脫落酸在病菌侵染前期顯著積累，TG1和TG2時(shí)期脫落酸含量顯著高于對(duì)照組，分別為 22.50和 18.08 ng·mL-1，隨后含量顯著減少。在TG3時(shí)期降低到與對(duì)照組同等水平13.79 ng·mL-1，在TG4時(shí)期達(dá)到最低值13.18 ng·mL-1，且含量顯著低于對(duì)照組 21.82 ng·mL-1（圖3）。

2.5 谷子脫落酸共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)鑒定

利用 gsg=goodSamplesGenes（datExpr，verbose=3），gsg$allOK參數(shù)測(cè)試數(shù)據(jù)的合理性，在所測(cè)RNA-seq數(shù)據(jù)中篩選軟閾值β=12構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖4-A），利用18 535個(gè)基因共得到34個(gè)基因共表達(dá)模塊（圖4-B）。其中MEturquoise模塊的基因數(shù)目最多有3 924個(gè)，MEdarkolivegreen模塊的基因數(shù)目最少，僅有43個(gè)。

圖1 谷子PYL和SnRK2家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of PYL and SnRK2 family genes in S.italica

圖2 谷子PYL和SnRK2家族基因的啟動(dòng)子順式作用元件分析Fig.2 Functions of promoter cis-acting elements in PYL and SnRK2 family genes in S.italica

圖3 脫落酸含量測(cè)定Fig.3 Determination of abscisic acid content

2.6 谷子脫落酸共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)鑒定

通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)與脫落酸含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)，鑒定到與脫落酸高度正相關(guān)的模塊為MEpaleturquoise模塊，相關(guān)性值為 0.56，其次為 MEbrown和 MEdarkolivegreen模塊，相關(guān)性值均為0.48（圖5-A）。其中負(fù)相關(guān)性中值最高的為 MEpink模塊，相關(guān)性值為-0.54（圖5-B），相關(guān)性絕對(duì)值最低的為MEdarkorange模塊，相關(guān)性值為0.024。對(duì)脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的SnRK2和PYL家族基因所在模塊的鑒定中發(fā)現(xiàn)（圖5-C），SnRK2和PYL所在模塊數(shù)目最多的為MEbrown模塊，占總數(shù)目的27%，其中該模塊中有4個(gè)PYL和2個(gè)SnRK2，表明該模塊也是脫落酸調(diào)控及發(fā)揮生理效應(yīng)的關(guān)鍵模塊。在MEturquoise模塊中有5個(gè)SnRK2，但該模塊與脫落酸含量的相關(guān)性絕對(duì)值僅為0.026，不存在相關(guān)性。有5個(gè)PYL和1個(gè)SnRK2不屬于任何模塊。故MEpaleturquoise和MEbrown為脫落酸及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)禾生指梗霉侵染的關(guān)鍵模塊。

圖4 軟閾值確定和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.4 Determination of soft threshold and construction of co-expression network

2.7 模塊的功能富集

對(duì)篩選的MEpaleturquoise和MEbrown模塊進(jìn)行功能富集分析（表2），其中MEpaleturquoise模塊顯著富集到 1-3-beta-D-葡聚糖生物合成過(guò)程（GO:0006075）、類黃酮代謝過(guò)程（GO:0051552）和類黃酮生物合成過(guò)程（GO:0051553），還富集到了鈣離子平衡（GO:0055074）和磷酸轉(zhuǎn)移酶活性（GO:0016780）等。MEbrown模塊富集到響應(yīng)真菌（GO:0009620）、生物刺激反應(yīng)（GO:0009607）、免疫系統(tǒng)的過(guò)程（GO:0002376）等與脅迫相關(guān)的功能；激素響應(yīng)（GO:0009725）、激素介導(dǎo)的信號(hào)通路（GO:0009755）、乙烯激活的信號(hào)通路（GO:0009873）和油菜素內(nèi)酯（GO:0009742）介導(dǎo)的信號(hào)通路等與激素相關(guān)的一些功能；以及蔗糖響應(yīng)（GO:0009744）、脂肪酸代謝（GO:0006631）和調(diào)節(jié)氮化合物代謝過(guò)程（GO:0051171）等與基礎(chǔ)代謝相關(guān)的功能。

對(duì)與脫落酸關(guān)聯(lián)的 MEpaleturquoise模塊和MEbrown模塊中以谷子PYL、SnRK2家族基因構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。其中 MEplaeturquoise中鑒定到 Seita.4G105600、Seita.6G218100和Seita.9G138400為該模塊的樞紐基因（圖6-A），Seita.4G105600在水稻和擬南芥中都被鑒定為含有 WD結(jié)構(gòu)域的超家族蛋白，Seita.6G218100在水稻中的同源基因?yàn)閃RKY57轉(zhuǎn)錄因子，在擬南芥中同源基因?yàn)榘琕Q基序的蛋白；Seita.9G138400在水稻和擬南芥中都注釋的為植物特有的響應(yīng)脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子TIFY（表3）。在脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的PYL和SnRK2家族基因有4個(gè)處于網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的樞紐位置（圖6-B），其中PYL家族基因的 Seita.1G013900和SnRK2家族基因的 Seita.2G394500在網(wǎng)絡(luò)中權(quán)重值較高，可能起主要調(diào)控作用。

2.8 表達(dá)模式分析

在響應(yīng)禾生指梗霉侵染的表達(dá)模式分析中，處理組中的PYL家族基因Seita.1G030500、Seita.3G207900、Seita.9G311900和Seita.9G437300均在前期表達(dá)水平較高，SnRK2家族基因Seita.2G394500、Seita.3G003200在TG1時(shí)期表達(dá)水平較高（圖7-A）。對(duì)谷子PYL和SnRK2家族基因與脫落酸含量進(jìn)行相關(guān)性分析，鑒定到基因Seita.1G030500、Seita.2G394500和Seita.3G003200顯著性最高，分別為0.80、0.65和0.72（圖7-B）。

圖5 關(guān)鍵模塊的鑒定Fig.5 Identification of key modules

圖6 MEpaleturquoise模塊內(nèi)基因和MEbrown模塊內(nèi)PYL、SnRK2家族基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Gene co-expression network of the MEpaleturquoise module and PYL, SnRK2 family genes in MEbrown module

表2 模塊GO富集情況Table 2 GO enrichments of network modules

表3 模塊核心基因功能注釋Table 3 Functional annotation of modular hub genes

2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

4個(gè)基因 Seita.2G394500、Seita.4G105600、Seita.6G218100和Seita.9G138400的熒光定量分析表明，基因Seita.2G394500在TG1、TG2時(shí)期的表達(dá)量顯著上調(diào)；基因Seita.4G105600和Seita.6G218100在TG2、TG3、TG4時(shí)期的表達(dá)量均高于對(duì)照組的表達(dá)量，且TG2、TG3時(shí)期表達(dá)量顯著上調(diào)；基因Seita.9G138400 5個(gè)時(shí)期表達(dá)量顯著下調(diào)（圖8）。

圖7 PYL和SnRK2家族基因表達(dá)模式及相關(guān)性分析Fig.7 Gene expression pattern and correlation analysis of PYL and SnRK2 families

3 討論

脫落酸可作為抗病性的抑制因子或增強(qiáng)劑，VLEESSCHAUWER等[27]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)水稻葉片施加脫落酸，可增加水稻對(duì)褐斑病的抗性，但ULFERTS等[28]發(fā)現(xiàn)脫落酸含量的升高導(dǎo)致稻瘟病菌對(duì)大麥葉片的危害加重。脫落酸在植物的防御反應(yīng)中扮演著復(fù)雜而矛盾的角色。本研究中，在禾生指梗霉早期侵染階段，脫落酸含量較對(duì)照組顯著增加，表明禾生指梗霉的侵染可能引起寄主內(nèi)源脫落酸含量的積累。鑒定出的 11個(gè)谷子SnRK2基因被分為3類，與水稻[29]、擬南芥[30]的研究結(jié)果一致，而且與玉米[31]、高粱[32]的研究結(jié)果類似，主要包括不依賴于脫落酸、不依賴于激酶或?qū)γ撀渌岬囊蕾囆匀鹾蛯?duì)脫落酸具有很強(qiáng)的依賴性 3類。谷子Seita.1G013900、Seita.4G239500基因與水稻中OsPYL3（LOC_Os02G15640）和OsPYL9（LOC_Os06g36670）同源性較高，這兩個(gè)基因在水稻中可以正向調(diào)控脫落酸信號(hào)，是真正的水稻脫落酸受體[33]，通過(guò)PYL和SnRK2的同源聚類分析驗(yàn)證了其在脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的重要作用。

圖8 不同時(shí)期基因表達(dá)量變化Fig.8 Changes in gene expression at different stages

在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析中，篩選到與脫落酸含量高度相關(guān)的MEpaleturquoise模塊，通過(guò)對(duì)該模塊的富集分析鑒定到了槲皮素、類黃酮和鈣離子平衡相關(guān)的功能。賈振華[34]用槲皮素處理野生型擬南芥后，活性氧含量增加，同時(shí)還出現(xiàn)活性氧爆發(fā)、過(guò)敏性細(xì)胞壞死、胼胝質(zhì)沉積等多種抗性反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)擬南芥對(duì)丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的抗性。PYL和SnRK2在脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有重要作用，在順式作用元件分析中，鑒定到PYL和SnRK2家族基因中存在與防御和脅迫響應(yīng)、脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、類黃酮等響應(yīng)元件，表明PYL和SnRK2家族基因在參與激素響應(yīng)脅迫方面可能發(fā)揮重要作用。在對(duì)PYL和SnRK2高度相關(guān)的MEbrown模塊富集中，富集到了大量與生物脅迫相關(guān)功能的基因，如免疫系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞壁大分子生物合成過(guò)程、脂肪酸代謝、油菜素內(nèi)酯、乙烯及生物刺激反應(yīng)等。脂肪酸代謝物甘油-3-磷酸（G3P）的積累可以提高擬南芥對(duì)炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）的抗性[35]，植物角質(zhì)層中的主要成分也是脂肪酸及其衍生物，對(duì)抵御病菌侵染具有重要作用[36]。油菜素內(nèi)酯可誘導(dǎo)水稻對(duì)煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、稻瘟病菌和水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）的抗性[37]。通過(guò)對(duì)谷子不同侵染、擴(kuò)展階段脫落酸含量的測(cè)定、生物信息學(xué)分析及不同時(shí)期表達(dá)量的測(cè)定，推測(cè)脫落酸在禾生指梗霉侵染過(guò)程中可能發(fā)揮著非常重要的作用。

本研究通過(guò)表達(dá)模式和相關(guān)性分析，鑒定到基因Seita.1G030500、Seita.2G394500和Seita.3G003200在脫落酸響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)到的3個(gè)核心基因中，Seita.4G105600在水稻和擬南芥中的同源基因均為含有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)的家族蛋白，WD40家族蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)脅迫方面具有重要作用，李寶燕[38]鑒定到含有WD40基序的NtTTG2通過(guò)協(xié)調(diào)生長(zhǎng)素和水楊酸提高抗病性。Seita.6G218100在水稻中的同源基因?yàn)閃RKY57，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在番茄上被報(bào)道為負(fù)調(diào)控番茄對(duì)灰霉病的抗性[39]。Seita.9G138400的同源基因在水稻和擬南芥中均被鑒定為 TIFY家族蛋白基因，TIFY家族蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素應(yīng)答和逆境脅迫方面具有重要作用，過(guò)表達(dá)VvTIFY9可提高葡萄對(duì)白粉病的抗性[40]。筆者推測(cè)，谷子內(nèi)源脫落酸在受到禾生指梗霉脅迫時(shí)，可能通過(guò) Seita.6G218100、Seita.4G105600和 Seita.9G138400基因編碼的WRKY57、WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白以及TIFY蛋白激活抗病響應(yīng)途徑。

4 結(jié)論

脫落酸在禾生指梗霉侵染谷子葉片早期大量積累，通過(guò)加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行脫落酸及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因PYL和SnRK2關(guān)聯(lián)分析，共篩選到6個(gè)基因參與谷子內(nèi)源脫落酸響應(yīng)禾生指梗霉侵染過(guò)程，包含 1個(gè)PYL家族基因、2個(gè)SnRK2家族基因、1個(gè)WD40家族蛋白基因、1個(gè)WRKY57轉(zhuǎn)錄因子和1個(gè)TIFY轉(zhuǎn)錄因子基因。經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)1個(gè)SnRK2家族基因、1個(gè)WD40家族蛋白基因和1個(gè)WRKY57轉(zhuǎn)錄因子基因共3個(gè)基因可能在谷子脫落酸響應(yīng)禾生指梗霉侵染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。