王 娟 張 婕 紀(jì)孝聯(lián)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，是全球癌癥死亡的主要原因，每年因胃癌死亡的患者占所有癌癥死亡人數(shù)的10%[1-3]。盡管手術(shù)、放化療等治療在日趨完善，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是胃癌治療失敗的主要原因。因此，確定胃癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素和其潛在的分子機(jī)制，對(duì)胃癌的診斷和治療均能起到至關(guān)重要的作用。大量研究[4-6]顯示，癌癥中miRNA的異常表達(dá)，可作為生物標(biāo)記物用于早期診斷或靶向治療。在miRNA的表達(dá)譜中已確定有29個(gè)miRNA在胃癌中表達(dá)異常，如miR-338-5p、miR-1915-3p和miR-3178等[7]。腫瘤中miRNA的異常表達(dá)常與凋亡相關(guān)基因有關(guān)，相關(guān)研究[8-10]等在結(jié)直腸癌中報(bào)道m(xù)iR-1915可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)介導(dǎo)多重耐藥機(jī)制。本文擬探討miR-1915-3p在胃癌中的表達(dá)水平及其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以期為胃癌的診斷或治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 永生化胃上皮細(xì)胞GES-1，人胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901和MKN-45均購(gòu)于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、噻唑藍(lán)粉末、和顯影劑等購(gòu)于北京鼎國(guó)有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和lipofeetamine 2000購(gòu)于日本TaKaRa公司；anti-Bcl-2、anti-β-actin和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)于Cell Signal公司；miR-1915-3p和miR-NC質(zhì)粒由廣州銳博生物有限公司合成；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于江蘇碧云天有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 永生化胃上皮細(xì)胞GES-1及人胃癌細(xì)胞MGC-803、SGC-7901和MKN-45用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。放置37℃含有5% CO2的恒溫箱中，當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶-EDTA消化，放入離心機(jī)中1 000 r/min，運(yùn)行5 min。用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，吸取1/3細(xì)胞接種至新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-1915-3p質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒(miR-NC)轉(zhuǎn)染至MGC-803、SGC-7901細(xì)胞中，分別設(shè)置為MGC-803細(xì)胞miR-1915-3p組和miR-NC組，SGC-7901細(xì)胞miR-1915-3p組和miR-NC組。胰酶消化MGC-803和SGC-7901細(xì)胞，并吹散成為單個(gè)懸浮細(xì)胞，離心洗滌后用無(wú)血清培養(yǎng)基(Serum-Free Medium，SFM)1640培養(yǎng)基重懸，在每孔含有440 μL SFM培養(yǎng)基的24孔板中接種約2×105個(gè)/孔的細(xì)胞；將5 μL濃度為20 μmol/L的miR-1915-3p和miR-NC加入到50 μL lopti-MEM中，輕輕混勻，室溫孵育5 min；在上述混合液中加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑lipofeetamine 2000，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min；將60 μL轉(zhuǎn)染試劑抑制物混合試劑加入含有細(xì)胞的孔板中，輕輕混勻，miR-1915-3p和miR-NC的轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmoL/L；將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，利用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803、SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1915-3p和miR-NC質(zhì)粒后miR-1915-3p的相對(duì)表達(dá)水平,重復(fù)3次，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-1915-3p組和miR-NC組細(xì)胞的OD值。將轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞以每孔3×103的密度接種于96孔板中，分別設(shè)置的培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6個(gè)平行孔，20 μL 噻唑藍(lán)溶液加入檢測(cè)孔中，繼續(xù)孵育4 h。然后去除上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，震蕩5 min然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處每個(gè)孔的OD值(活細(xì)胞的數(shù)量與OD值成正比)，重復(fù)3次并進(jìn)行組間比較。

1.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)不同組中miR-1915-3p的相對(duì)表達(dá)水平，收集細(xì)胞樣品根據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物設(shè)計(jì)如下：miR-1915-3p上游引物序列5′-AGAACGCATTGCCACATACA-3′，下游引物序列5′-TGCTTAACCCCTCA CCTTGA-3′ ，U6上游引物序列5′-CGCGAGAAGATGACCCAGATC -3′ ，下游引物序列5′- TGGTACGGCCAGAGGCG-3′。每種基因的表達(dá)變化用2-ΔΔCt法計(jì)算，以管家基因U6的mRNA水平作為內(nèi)參，重復(fù)3次計(jì)算不同組中miR-1915-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 凋亡實(shí)驗(yàn) 采用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測(cè)miR-1915-3p組和miR-NC組細(xì)胞的凋亡率。細(xì)胞以4×105的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)48 h以后收集細(xì)胞，分別加入390 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，室溫避光，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3次。右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，凋亡率=[(右下象限細(xì)胞數(shù)+右上象限細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)]×100%。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)miR-1915-3p組和miR-NC組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)情況。收集細(xì)胞提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒定取30 μg蛋白。制作10%的分離膠和5%的濃縮膠，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。根據(jù)maker和目的蛋白分子量大小切取適當(dāng)大小的膜，用5%脫脂奶粉封閉、一抗(1∶1 000)過(guò)夜孵育、TBST溶液清洗、二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h、TBST溶液清洗。配置一定量的顯影液，均勻滴加在膜上，置于Amersham Imager600凝膠成像系統(tǒng)中拍照。采用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析，以β-actin為內(nèi)參，重復(fù)3次比較不同組間Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-1915-3p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 miR-1915-3p在MGC-803、SGC-7901和MKN-45中的相對(duì)表達(dá)水平分別為(0.46±0.06)、(0.42±0.06)和(0.33±0.04)，均低于GES-1細(xì)胞(1.00±0.12)(t=13.817、14.902、17.035，P<0.05)。見圖1A。miR-1915-3p和miR-NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至在MGC-803和SGC-7901細(xì)胞后，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，miR-1915-3p組miR-1915-3p相對(duì)表達(dá)水平為(1.85±0.19)，高于miR-NC組的(1.00±0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.465，P=0.002)。見圖1B。在SGC-7901細(xì)胞中，miR-1915-3p組miR-1915-3p的相對(duì)表達(dá)水平為(1.74±0.10)，高于miR-NC組的(1.00±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.063，P<0.001)。見圖1C。

圖1 不同組間miR-1915-3p表達(dá)水平比較

2.2 miR-1915-3p組與miR-NC組OD值比較 在MGC-803細(xì)胞中，miR-1915-3p組細(xì)胞培養(yǎng)72 h的OD值為(0.67±0.07)，低于miR-NC組的(1.24±0.09)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.214，P<0.001)。在SGC-7901細(xì)胞中，miR-1915-3p組細(xì)胞培養(yǎng)72 h的OD值為(0.56±0.07)，低于miR-NC組的(0.92±0.08)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.041，P=0.008)。見圖2。

圖2 miR-1915-3p組與miR-NC組OD值比較

2.3 miR-1915-3p組與miR-NC組細(xì)胞凋亡率比較 MGC-803細(xì)胞中，miR-1915-3p組細(xì)胞凋亡率為(23.4±5.6)%，高于miR-NC組的(6.7±1.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.519，P=0.003)。SGC-7901細(xì)胞中，miR-1915-3p組細(xì)胞凋亡率為(34.7±10.2)%，高于miR-NC組的(7.2±1.5)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.684，P<0.001)。見圖3。

圖3 miR-1915-3p組與miR-NC組細(xì)胞凋亡率比較

2.4 miR-1915-3p組與miR-NC組Bcl-2蛋白表達(dá)比較 在MGC-803細(xì)胞中，miR-1915-3p組Bcl-2蛋白灰度值為(0.32±0.06)，低于miR-NC組的(0.86±0.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.325，P<0.001)。在SGC-7901細(xì)胞中，miR-1915-3p組Bcl-2蛋白灰度值為(0.18±0.08)，低于miR-NC組的(0.76±0.10)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.214，P<0.001)。見圖4。

圖4 miR-1915-3p組與miR-NC組Bcl-2蛋白表達(dá)比較

3 討論

近幾年，雖然治療胃癌的手術(shù)和放化療效果有所提升，但胃癌患者的5年生存率仍停留在20%左右[11]。分子靶向治療通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡在癌癥的治療中具有廣闊前景。非編碼RNA的生物功能在逐漸的被發(fā)現(xiàn)，包括miRNA，lncRNA，circRNA等。miRNA在癌癥中發(fā)揮重要作用，可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和其他生物學(xué)功能[12]。miRNA的表達(dá)失調(diào)與癌癥的發(fā)生發(fā)展以及藥物的抵抗作用有關(guān)[13]。miR-1915-3p可作為腎臟損傷的標(biāo)記物，用于評(píng)估糖尿病腎病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的腎臟損傷情況[14]，miR-1915和miR-1225-5p對(duì)腎干細(xì)胞和腎祖細(xì)胞有一定的調(diào)節(jié)功能[14]，miR-1915在結(jié)直腸癌的多重耐藥中發(fā)揮一定作用[10]，miR-1915-3p在骨髓間質(zhì)中的表達(dá)與細(xì)胞增殖和衰老有關(guān)[15]。細(xì)胞凋亡是一種受內(nèi)在基因調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)程序化死亡過(guò)程，是機(jī)體維持穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，細(xì)胞凋亡不足會(huì)引發(fā)癌癥。Bcl-2是抗細(xì)胞凋亡基因，通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞膜的通透性來(lái)抑制細(xì)胞色素C等促凋亡蛋白的釋放，阻止細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其表達(dá)下調(diào)可使腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增加。

本研究選取三種胃癌細(xì)胞系和一種永生化胃上皮細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果顯示在三種胃癌細(xì)胞系中，miR-1915-3p的表達(dá)水平顯著低于永生化胃上皮細(xì)胞(P<0.05)。為進(jìn)一步研究miR-1915-3p在胃癌中的作用機(jī)制，本研究將miR-1915-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，miR-1915-3p組胃癌細(xì)胞的增殖能力減弱，凋亡率顯著增加，miR-NC組胃癌細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，凋亡率低，以上結(jié)果表明胃癌細(xì)胞中miR-1915-3p的表達(dá)水平降低，可能參與了胃癌的進(jìn)展。Western blot結(jié)果顯示，miR-1915-3p組Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯減弱，Bcl-2基因是一種癌基因，它具有抑制凋亡的作用，近年來(lái)相關(guān)研究已開始揭示這一作用的機(jī)制。在本研究中，胃癌細(xì)胞中miR-1915-3p表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平較高，進(jìn)一步抑制胃癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)增殖，這可能是miR-1915-3p參與胃癌發(fā)生進(jìn)展的作用機(jī)制之一。Cui等[16]研究顯示，miR-1915-3p在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平降低，參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，可能成為胃癌治療的有效靶點(diǎn)之一，本研究與Cui等研究有相似之處。本研究還存在一定不足，僅針對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行研究，在胃癌組織中及癌旁組織中，miR-1915-3p的表達(dá)卻沒(méi)有涉及。在后續(xù)的研究中，筆者將集中研究胃癌組織中miR-1915-3p的表達(dá)水平，及其對(duì)患者臨床病理特征的相關(guān)性和生存率的影響。

綜上所述，miR-1915-3p在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)miR-1915-3p的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖，其可能機(jī)制為抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)以促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，這可能是胃癌發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制之一。