曹志秀，馬 超，張力卜，段小莉，李佳浩，張彥輝，徐 軍，2*，陳 昶，2*

（1.河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193）

咪鮮胺（prochloraz）是一種咪唑類廣譜殺菌劑，通過(guò)干擾菌體麥角甾醇的生物合成過(guò)程中的C14脫甲基反應(yīng)而發(fā)揮作用[1]，尤其對(duì)由子囊菌和半知菌引起的多種作物病害防效顯著，可用于治療和鏟除由核盤菌屬、鐮孢屬及白粉菌、炭疽菌等多種致病菌引起的油料作物、谷類、水果、蔬菜及經(jīng)濟(jì)作物的病害[2]，其高防效、高穩(wěn)定性及作物安全性受到了農(nóng)民的青睞。

氟環(huán)唑（epoxiconazole）是一類兼具保護(hù)和治理作用的新一代三唑類殺菌劑，具有較強(qiáng)的內(nèi)吸性[3]，可迅速被植株吸收并傳導(dǎo)至感病部位，阻止病害的侵染，其作用機(jī)理是通過(guò)抑制病菌麥角甾醇的合成，從而阻礙病菌細(xì)胞壁的形成致使病菌死亡[4]。該藥不僅有良好的鏟除活性，持效性長(zhǎng)[5-6]，還有誘導(dǎo)作物提高自身抗病性的作用[7]。

咪鮮胺和氟環(huán)唑進(jìn)行復(fù)配可以提高藥效，抑制由單一類型殺菌劑導(dǎo)致的抗病性的發(fā)展。30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑（商品名：鮮行者）是一種新型復(fù)配殺菌劑，能有效防治水稻紋枯病。目前關(guān)于咪鮮胺和氟環(huán)唑單劑的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外已有諸多報(bào)道，其中咪鮮胺單劑主要分析方法有HPLC[2]、GC-ECD和LC-MS/MS[8]，氟環(huán)唑單劑主要分析方法有HPLC[9]、GC（ECD或NPD）和LC-MS/MS[10-11]，但是兩者復(fù)配制劑30%咪鮮胺·氟環(huán)唑微乳劑的分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者采用反相高效液相色譜法，使用外標(biāo)法同時(shí)測(cè)定30%咪鮮胺·氟環(huán)唑微乳劑中2種有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，供相關(guān)人員參考。

1 試劑及儀器

1.1 試劑

甲醇（色譜級(jí)），默克（德國(guó)）股份兩合公司；乙腈（色譜級(jí)），飛世爾科技公司；水（新蒸二次蒸餾水）；咪鮮胺標(biāo)樣（已知含量不小于98%）和氟環(huán)唑標(biāo)樣（已知含量不小于98%），沈陽(yáng)化工研究院；30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑（20%咪鮮胺＋10%氟環(huán)唑），河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀和2489 UV-Vis檢測(cè)器，沃特世科技（上海）有限公司；UV-6100紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；0.45 μm孔徑的有機(jī)過(guò)濾器，天津科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；濾膜，上海密粒膜分離技術(shù)有限公司。

1.3 色譜操作條件

色譜柱為Inert Sustain C18Column不銹鋼柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）；流動(dòng)相為V甲醇∶V乙腈∶V水=30∶40∶30，經(jīng)濾膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣；柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm，進(jìn)樣量為5 μL。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配制

分別稱取咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g（純度為98.7%，精確至0.000 2 g）和氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g（純度為98.7%，精確至0.000 2 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40 mL甲醇，利用超聲波處理5 min，待標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解后定容并上下顛倒搖勻，制得咪鮮胺質(zhì)量濃度約為1 mg/mL、氟環(huán)唑質(zhì)量濃度約為0.5 mg/mL的標(biāo)樣溶液，進(jìn)行過(guò)濾后存于4℃冰箱待測(cè)。

稱取含咪鮮胺0.05 g和氟環(huán)唑0.025 g的試樣（精確至0.000 2 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40mL甲醇，利用超聲波處理15 min，待試樣完全溶解后定容并上下顛倒搖勻，制得質(zhì)量濃度約為5 mg/mL的試樣溶液，進(jìn)行過(guò)濾后存于4℃冰箱待測(cè)。

2.2 測(cè)定

用1.3中檢測(cè)試樣有效成分的檢測(cè)條件長(zhǎng)時(shí)間地平衡C18色譜柱和檢測(cè)儀器，觀察檢測(cè)器響應(yīng)值的波動(dòng)情況直到其持續(xù)呈現(xiàn)一條直線并無(wú)噪音干擾時(shí)（基線波動(dòng)范圍應(yīng)小于10-3），用標(biāo)樣溶液測(cè)試有效成分峰面積的相對(duì)偏差（應(yīng)小于1.5%），待色譜柱及儀器達(dá)到最佳檢測(cè)狀態(tài)，檢測(cè)誤差符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，取2.1中配制好的標(biāo)樣溶液和試樣溶液進(jìn)行測(cè)定。

2.3 計(jì)算

試樣中有效成分咪鮮胺或氟環(huán)唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w（%）按式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：A1為標(biāo)樣溶液中咪鮮胺（或氟環(huán)唑）峰面積的平均值，mAU；A2為試樣溶液中有效成分咪鮮胺（或氟環(huán)唑）檢測(cè)峰面積的平均值，mAU；m1為咪鮮胺（或氟環(huán)唑）標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，g；m2為試樣的質(zhì)量，g；P為咪鮮胺（或氟環(huán)唑）標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

3 結(jié)果分析與討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的判定

分別對(duì)咪鮮胺和氟環(huán)唑標(biāo)樣溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，獲得了兩者的紫外吸收光譜（圖1）。在205 nm和203 nm處，咪鮮胺和氟環(huán)唑的吸光度較高，但在實(shí)際檢測(cè)中，采用較低檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，靈敏度不佳。因此，本方法最終選定225 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，此處兩者均有較強(qiáng)吸收，且雜質(zhì)影響較小。

圖1 氟環(huán)唑和咪鮮胺紫外全波長(zhǎng)掃描圖

3.2 流動(dòng)相的選擇

在30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測(cè)中，通過(guò)不斷地調(diào)整流動(dòng)相中甲醇、乙腈和水的配制比例，觀察峰型變化和出峰快慢，依次對(duì)多種不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行篩選。最終檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)甲醇、乙腈、水的體積比為30∶40∶30時(shí)，分離效果最佳，色譜峰峰形尖銳，出峰時(shí)間短，滿足分析要求（圖2、圖3）。此外由于試樣由溶劑、助劑和有效成分配制而成，在試樣溶液的液相色譜圖（圖3）中，2.911min左右出現(xiàn)助劑峰，但與有效成分的峰之間分離效果良好，不影響檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。

圖2 標(biāo)樣液相色譜圖

圖3 30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑的液相色譜圖

3.3 分析方法的線性關(guān)系

稱取一定質(zhì)量的咪鮮胺和氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品，用純甲醇配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的咪鮮胺母液和質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的氟環(huán)唑母液于4℃冰箱保存。依次吸取咪鮮胺母液1.0、1.25、2.5、5.0、7.5mL進(jìn)行稀釋，制得0.20～2.0 mg/mL的一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液；依次吸取氟環(huán)唑母液1.0、1.25、2.5、5.0、7.5 mL進(jìn)行稀釋，制得0.10～1.0 mg/mL的一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液。之后用1.3的實(shí)驗(yàn)操作條件對(duì)各質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液進(jìn)行測(cè)定并記錄各針的檢測(cè)峰面積。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到咪鮮胺和氟環(huán)唑的線性方程。結(jié)果表明咪鮮胺和氟環(huán)唑均具有良好的線性關(guān)系，咪鮮胺的回歸方程為y=13 009.06 x＋193 422.30，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9；氟環(huán)唑的回歸方程為y=9 818.05 x＋43 258.51，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4（圖4、圖5）。

圖4 咪鮮胺線性關(guān)系圖

圖5 氟環(huán)唑線性關(guān)系圖

3.4 分析方法的精密度

在上述色譜檢測(cè)條件下，對(duì)30%咪鮮·氟環(huán)唑微乳劑試樣重復(fù)進(jìn)行5次獨(dú)立測(cè)試，有效成分相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于2（1-0.5logC）×0.67，其中C為樣品中有效成分含量，以小數(shù)計(jì)[12]。由檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，試樣中咪鮮胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.57%（＜1.711），氟環(huán)唑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.60%（＜1.890），均符合分析要求（n=5）。因此該分析方法的精密度良好（表1）。

表1 方法精密度測(cè)定結(jié)果（n=5）

3.5 分析方法的準(zhǔn)確度

稱取5份含咪鮮胺0.05 g和氟環(huán)唑0.025 g的已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣，再分別加入咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)品（約0.05 g）和氟環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品（約0.025 g），對(duì)其有效成分含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。咪鮮胺（100.09%）和氟環(huán)唑（99.94%）的平均回收率均較高，符合分析標(biāo)準(zhǔn)。

表2 分析方法的回收率測(cè)定結(jié)果（n=5）

4 結(jié) 論

本文針對(duì)30%咪鮮胺·氟環(huán)唑微乳劑建立了可以同時(shí)檢測(cè)有效成分咪鮮胺和氟環(huán)唑的高效液相色譜分析方法，并對(duì)此方法進(jìn)行了方法驗(yàn)證，結(jié)果表明咪鮮胺和氟環(huán)唑均具有良好的線性關(guān)系，分離效果較好，檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性良好，精密度較高，回收率均達(dá)到了99%以上，方法準(zhǔn)確度較高，且簡(jiǎn)單高效易操作，因此該方法可用于產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)，具有很強(qiáng)的可行性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。