古努爾·吐爾遜， 王登峰， 楊學(xué)云， 魏玉榮， 李建軍， 孟肖瀟， 洪都孜·波拉提， 吳建勇

(新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830013)

梅迪-維斯納病毒(Maedi-Visna virus，MVV)感染也稱為梅迪-維斯納病或綿羊進(jìn)行性肺炎(Ovine progressive pneumonia，OPP)，是綿羊的一種以進(jìn)行性消瘦和呼吸困難為臨床特征的慢性傳染病[1]。該病毒由Sigurdsson等[2]在1960年首次分離，是世界上首個(gè)得到臨床分離的慢病毒屬成員，與山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(Caprine arthritis encephalitis virus，CAEV)一起統(tǒng)稱為小反芻動(dòng)物慢病毒(Small ruminants lentivirus viruses，SRLVs)[3]。MVV主要通過母羊-羔羊垂直傳播和接觸性傳播2種途徑感染綿羊，多數(shù)感染羊表現(xiàn)出終身帶毒，但無明顯臨床癥狀，導(dǎo)致生產(chǎn)者和獸醫(yī)極易忽視或誤診梅迪-維斯納病，使其發(fā)生流行[4-5]。

目前，MVV呈世界性分布，亞洲、歐洲、非洲和美洲大陸均被報(bào)道存在該病，但不同國(guó)家的檢出率有所不同[2]。西班牙調(diào)查結(jié)果顯示，綿羊個(gè)體陽(yáng)性率高達(dá)24.8%～52.8%[6-7]；土耳其綿羊MVV抗體檢出率為15.3%～23.5%不等[8-10]。中國(guó)在20世紀(jì)80年代首次分離到該病毒，并發(fā)現(xiàn)該病毒在新疆純種邊區(qū)萊斯特羊中的檢出率高達(dá)44%[11-12]；最近中國(guó)采用進(jìn)口競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒開展了11個(gè)省份MVV血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示4個(gè)省份檢出MVV抗體陽(yáng)性羊，檢出率為0.81%～1.65%[13]，這說明部分地區(qū)仍然存在MVV感染和流行。因此，有必要制備診斷抗原，建立相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)方法，為該病的防控提供技術(shù)支撐。

從基因組結(jié)構(gòu)分析可知，MVV基因組RNA全長(zhǎng)為9～10 kb，由長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)、結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因(pol、gag和env)和調(diào)控基因(tat、rev和vif)等組成[14]，抗原基因主要分布于gag和env基因。其中，gag基因?yàn)榛蛐吞禺愋钥乖?，基于該基因多態(tài)性，可以將SRLVs分為A、B、C、D和E等5個(gè)基因型，不同基因型毒株gag蛋白氨基酸序列存在較高的相似性，有望成為檢測(cè)或診斷的候選抗原[15-16]。然而，中國(guó)目前已公開的MVV相關(guān)基因序列信息極少，在分析不同基因型毒株gag蛋白氨基酸序列和抗原特征等方面存在不足。因此，需要從野毒株中擴(kuò)增gag基因以了解中國(guó)MVV毒株gag基因和蛋白質(zhì)氨基酸序列的分子特征。

當(dāng)前，中國(guó)雖然有SRLVs檢疫技術(shù)規(guī)范，但無國(guó)產(chǎn)商品化檢測(cè)試劑盒的生產(chǎn)和供應(yīng)。過去常采用的瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)主要通過病毒的連續(xù)批量培養(yǎng)、濃縮后制備成診斷抗原[17]，因抗原制備過程較為復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高等原因，限制了抗原的批量生產(chǎn)與應(yīng)用。為此，本研究從實(shí)驗(yàn)室保存的MVV野毒株中克隆gag基因，在生物信息學(xué)分析MVV與CAEV gag蛋白氨基酸序列和抗原表位相似性的基礎(chǔ)上，通過gag蛋白原核表達(dá)和Western blotting驗(yàn)證分析其反應(yīng)原性，以期為研制MVV和CAEV通用檢測(cè)技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌(毒)株與載體 梅迪-維斯納病毒四川株、pET-22b質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α、BL21(DE3)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要試劑 D15000 DNA marker、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖械荣?gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，羧芐青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA Marker、LB培養(yǎng)基購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，蛋白質(zhì)Marker、XhoⅠ、NcoⅠ購(gòu)自Thermo Scientific公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗綿羊IgG購(gòu)自Earthox公司，兔抗山羊IgG抗體購(gòu)自Sigma公司，DNA連接酶、GoTaqGreen mastermix購(gòu)自Promega公司，QIAamp DNA mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司。綿羊抗MVV血清為綿羊自然感染MVV后的陽(yáng)性血清，山羊抗CAEV血清為山羊感染CAEV gs-35V株(基因組序列GenBank登錄號(hào)為KT749881)后的陽(yáng)性血清，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 以GenBank上登錄的MVV基因組gag基因序列(登錄號(hào)：NC001452.1)為參考序列，利用Oligo 7.0軟件設(shè)計(jì)上游引物gag-F：5′-CATGCCATGGCGAAGCAAGGCTCAAAGGAGA-3′(斜體為NcoⅠ酶切位點(diǎn))、下游引物gag-R：5′-AAACTCGAGCAACATAGGGGGCGCGGACGGCA-3′(斜體為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒基因組DNA的提取 采用QIAamp DNA mini Kit提取MVV前病毒基因組DNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 MVVgag基因的PCR擴(kuò)增 采用50 μl反應(yīng)體系：GoTaqGreen mastermix 25 μl，上、下游引物(20 mmol/L)各1 μl，基因組DNA 2 μl，水21 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，59.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸85 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，確定其大小后進(jìn)行膠回收。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將含pET-22b質(zhì)粒的菌種接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，采用質(zhì)粒快速提取試劑盒提取質(zhì)粒。用NcoⅠ和XhoⅠ分別雙酶切g(shù)ag、pET-22b并回收目的片段，將gag連接至pET-22載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，采用雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒pET-22b-gag交由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證其閱讀框是否正確。

1.2.4 MVV和CAEV gag蛋白的生物信息學(xué)分析 采用Lasergene分析中國(guó)MVV和CAEV gag蛋白氨基酸序列相似性，采用Predicted Antigenic Peptides[18]等在線工具分別預(yù)測(cè)gag蛋白抗原決定簇。

1.2.5 重組gag蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blotting分析 挑選陽(yáng)性pET-22b-gag質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，接種到含羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表達(dá)產(chǎn)物。同時(shí)，將誘導(dǎo)表達(dá)溫度降至28 ℃過夜(16～18 h)誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基上清液、菌體超聲波裂解物離心上清液和沉淀物，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式(可溶表達(dá)或不可溶表達(dá))。將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，一抗、二抗選擇如下：(1)以綿羊抗MVV血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗綿羊IgG抗體為二抗；(2)以山羊抗CAEV血清為一抗，HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體為二抗；均用TMB進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 MVV gag基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以梅迪-維斯納病毒前病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增后得到的目的片段大小約1.4 kb(圖1A)。將擴(kuò)增的gag基因片段插入pET-22b質(zhì)粒載體中，經(jīng)過雙酶切鑒定后可見1.4 kb和6.0 kb左右2個(gè)條帶(圖1B)。經(jīng)序列測(cè)定后確定插入片段大小為1 338 bp，與美國(guó)MVV 83/84株序列(登錄號(hào)：AY101611.1)的相似性為94.92%。目前，該序列已提交至GenBank(登錄號(hào)：KR011757.1)。

A：MVV gag基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M：DNA Marker G，1～2：gag基因，3：空白對(duì)照；B：pET-22b-gag重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果，其中N：D15000 DNA marker，1～9：pET-22b-gag陽(yáng)性重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果；10：pET-22b雙酶切鑒定結(jié)果。圖1 MVV gag基因PCR擴(kuò)增與重組質(zhì)粒pET-22b-gag酶切鑒定結(jié)果Fig.1 The results of maedi-visna virus(MVV) gag gene amplified by PCR and recombinant plasmid pET-22b-gag by enzymatic digestion

2.2 gag蛋白氨基酸序列與抗原表位分析

將測(cè)序獲得的gag基因序列翻譯成gag蛋白氨基酸序列，與SRLVs A型(GenBank登錄號(hào)為AY101611)、B型(GenBank登錄號(hào)為M33677)、C型(GenBank登錄號(hào)為AF322109)、E型(GenBank登錄號(hào)為EU293537)gag蛋白氨基酸序列的相似性為67.7%～96.6%；與國(guó)內(nèi)CAEV gs-35V株(GenBank登錄號(hào)為KT749881)、CAEV山東株(GenBank登錄號(hào)為KT749878)、CAEV四川株(GenBank登錄號(hào)為KT214469)、CAEV貴州株(GenBank登錄號(hào)為KT749880)和CAEV陜西株(GenBank登錄號(hào)為KT749879)gag蛋白氨基酸序列的相似性為74.7%～74.9%(表1)。

進(jìn)一步通過抗原表位預(yù)測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)MVV四川株和CAEV gs-35V株的gag蛋白均存在17個(gè)抗原表位，其中MVV四川株gag蛋白的11個(gè)抗原表位與CAEV gs-35V株gag蛋白的12個(gè)抗原表位存在較高的序列相似性(圖2)，表明本研究中的MVV gag蛋白可能具備與抗CAEV血清交叉反應(yīng)的能力。

表1 MVV四川株與SRLVs gag蛋白氨基酸序列相似性分析結(jié)果

陰影部分表示氨基酸相似性位點(diǎn)。圖2 MVV與CAEV gag抗原表位的預(yù)測(cè)與分析Fig.2 Prediction and analysis of gag epitopes between MVV and Caprine arthritis encephalitis virus(CAEV)

2.3 MVV gag重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)與反應(yīng)原性分析

根據(jù)以上分析結(jié)果，將重組表達(dá)載體pET-22b-gag轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，可見約55 000的目的蛋白條帶(圖3A)。經(jīng)BandScan 5.0軟件分析，目的蛋白質(zhì)量占總蛋白質(zhì)量的23.6%。低溫過夜誘導(dǎo)表達(dá)后，菌體超聲波裂解離心上清液和沉淀物中均出現(xiàn)了目的條帶(圖3B)，說明重組gag蛋白同時(shí)存在可溶性及不可溶性(包涵體)2種表達(dá)形式，但以包涵體表達(dá)形式為主。

分別采用綿羊抗MVV血清和山羊抗CAEV血清作為一抗檢測(cè)重組gag蛋白的反應(yīng)原性，結(jié)果表明，重組gag蛋白與綿羊抗MVV血清(圖4A)和山羊抗CAEV血清(圖4B)均出現(xiàn)血清學(xué)反應(yīng)，說明重組gag蛋白具有與天然MVV和CAEV gag蛋白相似的反應(yīng)原性，證實(shí)了生物信息學(xué)分析的相關(guān)結(jié)果。

A：重組gag蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；B：重組gag蛋白表達(dá)形式的檢測(cè)結(jié)果。M：蛋白Marker；1：BL21(DE3)空載對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；2：pET-22b-gag/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；3：空白對(duì)照；4：pET-22b-gag/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基上清液；5：pET-22b-gag/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲裂解上清液；6：pET-22b-gag/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲裂解沉淀物。圖3 重組gag蛋白在E. coli BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)與分布Fig.3 Induced expression and distribution of recombinant gag protein in Escherichia coli BL21(DE3)

A：以綿羊抗MVV血清為一抗的Western blotting分析；B：以山羊抗CAEV血清為一抗的Western blotting分析；M：蛋白Marker；1：pET-22b/BL21(DE3)空載對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；2：pET-22b-gag/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)陽(yáng)性對(duì)照。圖4 重組gag蛋白交叉反應(yīng)原性分析Fig.4 Cross reactogenicity analysis of recombinant gag protein

3 討 論

梅迪-維斯納病被中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為二類動(dòng)物疫病，也被中國(guó)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局列為出入境貿(mào)易需要檢疫的動(dòng)物疫病。它的慢性和隱性感染不僅增加了發(fā)現(xiàn)該病的難度，還對(duì)中國(guó)綿羊養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了一定的威脅[19]。國(guó)際上一般將MVV與CAEV合稱為SRLVs，其中，CAEV為中國(guó)科研人員于20世紀(jì)80年代從進(jìn)口薩能奶山羊中檢出并分離的病毒[20-21]，被視為外來輸入性傳染病原。本實(shí)驗(yàn)室保存有中國(guó)分離的多數(shù)毒株，對(duì)這些毒株[CAEV gs-35V株(GenBank登錄號(hào)為KT749881)、CAEV山東株(GenBank登錄號(hào)為KT749878)、CAEV四川株(GenBank登錄號(hào)為KT214469)、CAEV貴州株(GenBank登錄號(hào)為KT749880)和CAEV陜西株(GenBank登錄號(hào)為KT749879)]進(jìn)行g(shù)ag基因相似性分析，gag基因高度相似(>99%)，說明中國(guó)CAEV病原較為單一。而中國(guó)MVV分離株較少，其病原分子生物學(xué)特征數(shù)據(jù)也鮮有報(bào)道。本研究嘗試以中國(guó)MVV分離株為模板擴(kuò)增獲得gag基因序列，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，MVV gag蛋白氨基酸序列與中國(guó)CAEV分離株的相似性為74.7%～74.9%，且其11個(gè)抗原表位與CAEV gag蛋白的12個(gè)抗原表位具有較高的序列相似性，說明MVV gag蛋白具備與抗CAEV血清產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在各種表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌的原核表達(dá)系統(tǒng)是最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)之一[22]。它通過將目的基因片段插入原核表達(dá)載體，經(jīng)過誘導(dǎo)表達(dá)與純化獲得所需的重組蛋白。該方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得目的基因表達(dá)產(chǎn)物，成本較為低廉，是目前主要選擇的原核表達(dá)系統(tǒng)。本研究通過將重組pET-22b-gag質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌株，成功實(shí)現(xiàn)了gag蛋白的原核表達(dá)，經(jīng)Western blotting證實(shí)重組gag蛋白具備天然MVV和CAEV gag蛋白相似的反應(yīng)原性，該研究結(jié)果可為進(jìn)一步研制SRLVs通用血清學(xué)檢測(cè)方法提供技術(shù)支撐。

綜上所述，本研究通過分析中國(guó)MVV分離株gag蛋白氨基酸序列與中國(guó)CAEV分離株gag蛋白氨基酸序列的相似性和兩者抗原表位的相似性，推測(cè)其可作為中國(guó)SRLVs的通用血清學(xué)診斷標(biāo)記蛋白；以MVV的gag基因?yàn)槟０鍢?gòu)建了gag基因重組表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的表達(dá)，并經(jīng)Western blotting證實(shí)了上述推測(cè)，研究結(jié)果為研制適合中國(guó)的SRLVs通用血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)方法奠定了基礎(chǔ)。