張鈞杰，楊潔，張青，李金磊，吳寧鵬，吳志明*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002; 2. 河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

大腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)的共生菌，在一定條件下可以引起人和多種動(dòng)物發(fā)生胃腸道、尿道等多種局部組織器官感染。豬大腸桿菌病是由致病性大腸埃希氏菌引起的一種常見(jiàn)、多發(fā)的仔豬傳染病，其發(fā)病率和死亡率均居仔豬疫病之首，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而且其血清型眾多、臨床癥狀和病理變化復(fù)雜，疫苗防治效果較差，臨床上常用抗菌藥物治療，但由于抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性或超級(jí)細(xì)菌[1-3]。而耐藥菌會(huì)隨畜禽糞便排出，對(duì)環(huán)境中的土著細(xì)菌產(chǎn)生影響[4-5]，也會(huì)造成多重耐藥[6-7]。為掌握河南省豬源大腸桿菌的耐藥情況，本研究于2013年至2018年間對(duì)河南省鄭州、開(kāi)封、焦作、許昌4個(gè)地區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)分離出的856株大腸桿菌，經(jīng)過(guò)對(duì)8類13種抗菌藥物的耐藥性調(diào)查，分析比較不同年份間和不同地區(qū)間豬源大腸桿菌的耐藥情況及其流行規(guī)律，以期為指導(dǎo)獸醫(yī)臨床科學(xué)用藥和保障畜產(chǎn)品安全提供可持續(xù)發(fā)展思路。

1 材料與方法

1.1 菌株 所有樣本均采用肛門拭子法采集，經(jīng)分離純化和常規(guī)鑒定后得到，鄭州、開(kāi)封、焦作、許昌分別為190株、154株、287株、225株，共計(jì)856株；質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 試劑 一次性無(wú)菌采樣棒(BPW)，購(gòu)自鄭州君越公司；麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定板，購(gòu)自BD公司；革蘭氏陰性細(xì)菌藥敏試劑盒，購(gòu)自上海星佰生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 低溫可疊放搖床(MaxQSHKE6000-8CE)，購(gòu)自Thermo公司；細(xì)菌濁度儀，購(gòu)自北京中西遠(yuǎn)大科技公司；全自動(dòng)細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(BD PhoenixTM-100)，購(gòu)自BD公司；高壓滅菌鍋，購(gòu)自上海三申醫(yī)療器械有限公司；電子天平，購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.4 大腸桿菌的分離與鑒定 使用一次性無(wú)菌采樣棒，采取豬的肛門分泌物，然后在恒溫培養(yǎng)箱中(36±1) ℃條件下培養(yǎng)16～20 h，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，然后用一次性無(wú)菌塑料接種環(huán)取預(yù)增液1～2環(huán)，于麥康凱瓊脂平板上培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱中(36±1) ℃條件下培養(yǎng)16～20 h，再選取單個(gè)典型可疑菌落在麥康凱瓊脂上劃線進(jìn)行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，挑取單個(gè)菌落用全自動(dòng)細(xì)菌/藥敏鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.5 藥敏實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)鑒定的大腸桿菌，用生理鹽水調(diào)制0.5麥?zhǔn)蠞舛群?，然后再用試劑盒中的肉湯進(jìn)行100倍稀釋，混勻備用。除空白對(duì)照外，其余的95孔加入制備好的菌液100 μL，空白對(duì)照孔中加入100 μL無(wú)菌肉湯，將96孔藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)板放置恒溫培養(yǎng)箱中孵育，讀取藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定結(jié)果 2013年至2018年，經(jīng)分離鑒定，共獲得856株大腸桿菌，分離率為80.0%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2013～2018年豬源大腸桿菌分離鑒定結(jié)果Tab 1 Results of isolation and identification of Escherichia coli from swine in 2013～2018

2.2 不同地區(qū)大腸桿菌的耐藥情況 從表2可以看出，從河南省四個(gè)地區(qū)分離的豬源大腸桿菌對(duì)13種藥物的耐藥率范圍分別為：鄭州10.3%～88.4%、開(kāi)封22.4%～93.8%、焦作11.8%～96.4%、許昌21.1%～98.2%。分離菌耐藥率在35.0%以下的藥物有6種，分別是氧氟沙星、恩諾沙星、黏菌素、慶大霉素、頭孢噻呋和阿莫西林/棒酸，其中鄭州有5種，焦作有6種，開(kāi)封和許昌皆為3種；耐藥率在90.0%以上的藥物有5種，分別是四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑和氨芐西林，其中許昌有5種，開(kāi)封和焦作皆為3種，鄭州為0。鄭州、開(kāi)封地區(qū)分離菌對(duì)頭孢噻呋平均耐藥率最低分別為10.3%和22.4%，對(duì)四環(huán)素平均耐藥率最高分別為88.4%和93.8%；焦作地區(qū)分離菌對(duì)黏菌素平均耐藥率最低為11.8%，對(duì)四環(huán)素平均耐藥率最高為96.4%；許昌地區(qū)分離菌對(duì)阿莫西林/棒酸平均耐藥率最低為21.1%，對(duì)四環(huán)素平均耐藥率最高為98.2%。鄭州、焦作地區(qū)分離菌對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、黏菌素、大觀霉素、頭孢噻呋和氨芐西林的耐藥率水平相當(dāng)，但均低于開(kāi)封和許昌地區(qū)；焦作地區(qū)分離菌對(duì)氧氟沙星和慶大霉素的耐藥率低于其他三個(gè)地區(qū)。

表2 2013～2018年四個(gè)地區(qū)分離856株豬源大腸桿菌對(duì)13種抗菌藥物耐藥性結(jié)果Table 2 Results of the isolation of 856 strains of E.coli Isolated from pigs to 13 antimicrobial agents in four regions from 2013 to 2018

2.3 不同年份大腸桿菌的耐藥情況 結(jié)果見(jiàn)表3。2013～2018年豬源大腸桿菌的耐藥率范圍為56.6%～63.8%。2013～2018年分離菌耐藥率在35.0%以下的藥物有6種，分別是氧氟沙星、恩諾沙星、黏菌素、慶大霉素、頭孢噻呋和阿莫西林/棒酸，其中2013年和2014年皆為4種，2015年有3種，2016年有6種，2017年和2018年皆為5種。分離菌耐藥率在90.0%以上的藥物有6 種，分別是四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明和氨芐西林，其中2013年和2014年皆為2種，2015年和2016年皆為3種，2017年有1種，2018年有5種。2013年和2014年分離菌均對(duì)頭孢噻呋耐藥率最低，分別為3.6%和4.1%，均對(duì)四環(huán)素耐藥率最高，分別為94.4%和94.2%；2015年分離菌對(duì)阿莫西林/棒酸耐藥率最低為2.3%，對(duì)氟苯尼考耐藥率最高為93.8%；2016年分離菌對(duì)阿莫西林/棒酸耐藥率最低為5.9%，對(duì)氟苯尼考和四環(huán)素耐藥率最高為97.6%；2017年分離菌對(duì)粘菌素耐藥率最低為5.6%，對(duì)四環(huán)素耐藥率最高為94.4%；2018年分離菌對(duì)粘菌素耐藥率最低為0.0%，對(duì)多西環(huán)素耐藥率最高為100.0%。對(duì)黏菌素的耐藥率在2013年至2015年持續(xù)升高達(dá)到55.0%后，開(kāi)始大幅下降，在2018年降為0.0%；對(duì)四環(huán)素的耐藥率連續(xù)6年皆在90.0%以上；對(duì)多西環(huán)素的耐藥率整體保持較高水平，在2018年上升至100.0%。

表3 2013～2018年856株豬源大腸桿菌對(duì)13種抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 drug sensitivity test results of 856 strains of E.coli from pigs to13 antimicrobial agents in 2013～2018

2.4 豬源大腸桿菌多重耐藥情況 2013年至2018年多重耐藥主要集中在耐5、6和7類抗生素。2013年有91.8%的菌株耐3類及以上藥物，其中耐5類抗生素的菌株最多，為35.7%；2014年有90.0%的菌株耐3類及以上藥物，其中耐5類和7類抗生素的菌株最多，均為19.9%；2015年有94.6%的菌株耐3類及以上藥物，其中耐7類抗生素的菌株最多，為27.1%；2016年有92.6%的菌株耐3類及以上藥物，其中耐5類抗生素的菌株最多，為46.3%；2017年有94.5%的菌株耐3類及以上藥物，其中耐6類抗生素的菌株最多，為28.9%；2018年100.0%的菌株耐3類及以上藥物，其中耐5類抗生素的菌株最多，為43.0%。

從圖1可以看出，耐0類抗生素的菌株比例為零；耐1類、2類和3類抗生素的菌株比例在11.1%以下；耐4類抗生素的菌株比例整體保持平緩趨勢(shì)，維持在15.0%左右；耐5類抗生素的菌株變化起伏較大，但整體維持在30.0%左右；耐6類抗生素的菌株比例整體呈上升趨勢(shì)；耐7類和8類抗生素的菌株比例整體呈下降趨勢(shì)。

圖1 2013～2018年856株豬源大腸桿菌對(duì)8類抗菌 藥物的多重耐藥情況Fig 1 Multidrug resistance of 856 strains of E.coli from swine to 8 kinds of antibiotics in 2013～2018

3 討論與結(jié)論

結(jié)果表明，從河南省鄭州、開(kāi)封、焦作、許昌四個(gè)地區(qū)分離的豬源大腸桿菌，對(duì)13種藥物耐藥分布有些微差異，其中鄭州和焦作地區(qū)分離菌對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、黏菌素、大觀霉素、頭孢噻呋和氨芐西林六種藥物耐藥率低于開(kāi)封和許昌地區(qū)，焦作地區(qū)分離菌對(duì)氧氟沙星和慶大霉素耐藥率顯著低于其他三個(gè)地區(qū)，這種差異可能與各地區(qū)的藥物使用習(xí)慣有關(guān)。

2013～2018年豬源大腸桿菌的平均耐藥率整體保持平穩(wěn)，無(wú)明顯的年份差異。分離菌對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素等12種抗菌藥物的耐藥率與吳寧鵬[8]在2014至2015年對(duì)焦作和許昌地區(qū)的研究結(jié)果基本一致，但對(duì)黏菌素的耐藥率100.0%與本研究31.1%相差較大；對(duì)恩諾沙星、四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率與李杰[9]在2017年對(duì)南陽(yáng)地區(qū)的研究結(jié)果基本一致；對(duì)磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明和氨芐西林的耐藥率大于80.0%，與艾偉昌在2017年對(duì)河南地區(qū)的研究結(jié)果吻合[10]；對(duì)氟苯尼考的耐藥率從2013年的76.0%上升至2018年的90.0%，一直處于較高水平[11-12]，與其在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療豬源大腸桿菌病有關(guān)；對(duì)頭孢噻呋的耐藥率與李進(jìn)福在2015年對(duì)河南的鄭州、開(kāi)封、新鄉(xiāng)等8個(gè)地區(qū)的研究結(jié)果一致[13]；黏菌素作為人類抵抗細(xì)菌耐藥性的“最后一道防線”[14]，耐藥率從2013年的32.1%升高至2015年的55.0%，在2018年降為0.0%，跟我國(guó)在2016年出臺(tái)的農(nóng)業(yè)部2428號(hào)公告禁止硫酸黏菌素用于動(dòng)物促生長(zhǎng)政策有關(guān)，與毛福超和張晗珺研究[15-16]相似，說(shuō)明對(duì)抗菌藥物監(jiān)管政策的加強(qiáng)，可有效降低藥物的耐藥性。

在多重耐藥方面，2013至2018年有大于90.0%的菌株對(duì)3類及以上藥物耐藥，其中耐5、6和7類抗生素的菌株比例最高，而耐6類抗生素的菌株比例整體呈上升趨勢(shì)，從中可以看出我國(guó)豬源大腸桿菌的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。

本研究結(jié)果表明河南省部分養(yǎng)殖場(chǎng)中豬源大腸桿菌耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，與其他作者對(duì)河南省研究結(jié)果相似。因此，建議應(yīng)加強(qiáng)對(duì)大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)，針對(duì)其結(jié)果合理使用抗菌藥物。