黃 建，段婧婧，馬曉東，祁 通，付彥博

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素，在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有重要的作用[1]。鹽漬化是世界性的資源和生態(tài)問題[2]，通常鹽漬化土壤的pH值較高，鹽漬化土壤中氮素的含量較低。很多鹽生植物卻能夠在鹽環(huán)境下生長(zhǎng)發(fā)育并形成生物量。鹽角草(Saliconia-Europea L.)又名海蓬子，為藜科鹽角草屬一年生雙子葉草本植物[3]，其耐鹽極限濃度可達(dá)到5% NaCl，內(nèi)莖的可溶性鹽分含量達(dá)37%[4]。鹽角草的強(qiáng)耐鹽性，能夠在很多鹽漬化地區(qū)種植，其植株蛋白質(zhì)含量很高[5]，甚至可以達(dá)到豆科牧草的水平，部分鹽生植物可作為鹽堿地區(qū)改良利用的飼料作物[6]。【前人研究進(jìn)展】鹽角草能夠在鹽漬化土壤環(huán)境下正常生長(zhǎng)，在人工模擬的人體尿液也能正常生長(zhǎng)[7]，研究表明，高濃度的尿素能夠促進(jìn)鹽角草的生物量的增加[8]。 硝酸還原酶作為誘導(dǎo)酶，是植物體內(nèi)氮素同化的第一個(gè)關(guān)鍵酶，也是整個(gè)同化過程的限速酶，在植物氮素同化過程中起關(guān)鍵作用[9]。鹽角草不僅具有高耐鹽能力，同時(shí)還具有高耐氮能力?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于鹽漬化生境中鹽角草氮素吸收利用特性的系統(tǒng)研究還未見報(bào)道。采用盆栽方法分析鹽環(huán)境下氮素對(duì)苗期鹽角草氮同化關(guān)鍵酶活性的影響，研究鹽角草氮素吸收與同化機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究干旱區(qū)鹽環(huán)境下不同氮水平下鹽角草氮素同化吸收機(jī)制作，為鹽堿地區(qū)鹽角草的種植栽培及鹽漬土的生物改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2019年4～8月在新疆喀什岳普湖縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心試驗(yàn)站，N39°14'50"，E76°44'45"，屬暖溫帶大陸性干旱氣候。年平均氣溫11.8℃，極端低溫-23.4℃，極端高溫41.5℃，日照全年平均值2 780.3 h，平均無(wú)霜期232 d，年降水量66.4 mm。鹽角草種子采自中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所克拉瑪依鹽生植物園，鹽角草(Salicornia-EuropaeaL.)為藜科(Chenopodiaceae)鹽角草屬(SalicorniaL．)的聚鹽鹽生植物(Ushakova et al, 2006)。供試鹽堿土取自岳普湖縣農(nóng)田重度鹽堿土，土壤質(zhì)地為灌淤土，土壤pH值為8.58，總鹽為10.9 g/kg，全氮為0.31 g/kg，全磷為0.62 g/kg，全鉀為21.40 mg/kg，速效氮為34.00 mg/kg，速效磷為8.87 mg/kg，速效鉀為107.33 mg/kg。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽土培的方法進(jìn)行栽培種植，將供試土壤過5 mm篩，混合均勻并裝盆，每盆裝土2 kg，供試盆為塑料盆，高18 cm，內(nèi)徑16 cm。選擇大小一致的鹽角草種子播種于塑料盆中，每盆播50粒種子，在表面覆沙1 cm，在人工溫室中培養(yǎng)至苗高4 cm時(shí)定植8株，移至室外繼續(xù)培育待苗長(zhǎng)至高10 cm左右時(shí)開始處理。氮素以尿素(含氮為46%)形式溶解于水中一次性加入，氮素(以每千克土壤所含純N計(jì)) 設(shè)5個(gè)水平，即N0(不施氮)、N1(施氮0.3 g/kg)、N2(施氮0.6 g/kg)、N3(施氮1.2 g/kg)、N4(施氮2.4 g/kg)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，共計(jì)20盆，定時(shí)定量補(bǔ)充植物每天所需水分。于2019年5月20日在正式處理30 d后進(jìn)行采樣及各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.2.1 粗酶提取

取鹽角草根、莖、同化枝鮮樣各0.1 g，洗凈剪碎，放在研缽中置低溫冰箱冷凍30 min。取出在冰浴中加0.9 mL PBS緩沖液。研磨為勻漿，低溫離心10 min(10 000 r/min)，上清液即為粗酶提取液。

1.2.2.2 酶活性

采用酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測(cè)定，設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣在酶標(biāo)板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第1、第2孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，然后在第1、第2孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；然后從第1孔、第2孔中各取100 μL分別加到第3孔和第4孔，再在第3、第4孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；然后在第3孔和第4孔中先各取50 μL棄掉，再各取50 μL分別加到第5、第6孔中，再在第5、第6孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；混勻后從第5、第6孔中各取50 μL分別加到第7、第8孔中，再在第7、第8孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻后從第7、第8孔中分別取50 μL加到第9、第10孔中，再在第9第10孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻后從第9和第10孔中各取50 μL棄掉。

(2)加樣分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

(3)溫育用封板膜封板后置37℃溫育30 min。

(4)配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。

(5)洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。

(6)加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。

(7)溫育操作同(3)。

(8)洗滌操作同(5)。

(8)顯色每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

(10)終止每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。

(11)測(cè)定：以空白空調(diào)零，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品抗原濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得每處理3個(gè)重復(fù)的數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)(Duncan法，P﹤0.05)，圖形均采用Origin 8.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施N水平對(duì)鹽環(huán)境下鹽角草幼苗NR活性的影響

研究表明,在相同氮素處理下，鹽角草在不施氮及N1處理下，根、莖、同化枝活體NR活性呈顯著增加的趨勢(shì)，在N2、N3、N4處理下鹽角草根活體的NR活性逐漸大于莖、同化枝；在不同氮素處理下，隨著氮素處理濃度的增大，鹽角草根活體NR活性呈顯著增加的趨勢(shì)，隨著氮素濃度的升高，NR活性略微下降；鹽角草莖活體NR活性不施氮與N1處理差異不顯著，與N2、N3、N4處理差異顯著，而N2、N3、N4處理之間差異不顯著；鹽角草同化枝活體NR活性不施氮、N1、N2、N4之間差異不顯著，與N3差異顯著。鹽角草根、莖、同化枝活體NR活性在N3處理濃度下達(dá)到最大值。

注：誤差線上不同大寫字母表示同一處理間不同部位在P≤0.05時(shí)有顯著差異，不同小寫字母表示同一部位下不同氮素處理在P≤0.05時(shí)有顯著差異Note：Different capital letters on the error line indicate significant differences between different parts of the same treatment at P≤0.05, while different lowercase letters indicate significant differences between different nitrogen treatments at P≤005.圖1 不同氮處理下鹽角草硝酸還原酶活性變化特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Fig.1 Variation characteristics of Salicornia europaea L. nitrate reductase activity at different nitrogen levels (mean ±SD)

2.2 不同施N水平對(duì)鹽環(huán)境下鹽角草幼苗GS活性的影響

研究表明,在相同氮素處理下，鹽角草在不施氮處理下，鹽角草同化枝活體GS活性顯著低于根、莖，在N1、N2、N3處理下鹽角草根、莖、同化枝活體GS活性差異不顯著，在N4處理下，鹽角草根活體GS活性顯著高于莖、同化枝；在不同氮素處理下，鹽角草根活體GS活性呈增加的趨勢(shì)，不施氮與N1、N2差異不顯著，與N3、N4差異顯著；鹽角草莖活體GS活性不施氮與N4差異不顯著，與N1、N2、N3處理差異顯著；鹽角草同化枝活體GS活性不施氮顯著低于各施氮處理，各施氮處理之間差異不顯著。鹽角草根、同化枝活體GS活性在N4處理時(shí)最大，莖在N3時(shí)最大。圖2

圖2 不同氮處理下鹽角草谷氨酰胺合成酶活性變化特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Fig.2 Variation characteristics of Salicornia europaea L. glutamine synthetase activity at different nitrogen levels (mean ±SD)

2.3 不同施N水平對(duì)鹽環(huán)境下鹽角草幼苗GOGAT活性的影響

研究表明，在不施氮、N1、N2處理下，鹽角草根、莖、同化枝活體GOGAT活性差異不顯著，在N3處理時(shí)，鹽角草根、莖、同化枝活體GOGAT活性呈顯著降低，在N4處理時(shí)，鹽角草根活體GOGAT活性顯著高于莖、同化枝；在不同施氮處理下，鹽角草根活體GOGAT活性呈逐漸升高的趨勢(shì)，不施氮、N1、N2差異不顯著，與N3、N4之間差異顯著；鹽角草莖活體GOGAT活性不施氮、N1、N2、N4之間差異不顯著，與N3處理差異顯著；鹽角草同化枝活體GOGAT活性不施氮、N1、N2、N3之間差異不顯著，與N4處理差異顯著。鹽角草根、同化枝活體GOGAT活性在N4處理時(shí)最大，莖在N3時(shí)最大。圖3

圖3 不同氮處理下鹽角草谷氨酸合成酶活性變化特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Fig.3 Variation characteristics of Salicornia europaea L. glutamate synthase activity at different nitrogen levels (mean ±SD)

2.4 不同施N水平對(duì)鹽環(huán)境下鹽角草幼苗GLDH活性的影響

研究表明,在不施氮、N1、N4處理下，鹽角草根、莖、同化枝活體GLDH活性差異不顯著，在N3、N4處理時(shí)，鹽角草根活體GLDH活性顯著低于莖、同化枝；在不同施氮處理下，鹽角草根活體GLDH活性呈逐漸升高的趨勢(shì)，N1、N2、N3處理之間差異不顯著，與不施氮、N4之間差異顯著；鹽角草莖活體GLDH活性不施氮與施氮處理差異顯著，各施氮處理之間差異不顯著；鹽角草同化枝活體GLDH活性與莖有相同的趨勢(shì)。鹽角草根、莖、同化枝活體GLDH活性均在N4處理時(shí)最大。

圖4 不同氮處理下鹽角草谷氨酸脫氧酶活性變化特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)Fig.4 Variation characteristics of Salicornia europaea L. glutamate deoxygenase activity at different nitrogen levels (mean ±SD)

3 討 論

4 結(jié) 論

4.1 與不施氮處理相比，在重度鹽環(huán)境條件下，施氮可現(xiàn)在提高鹽角草幼苗根、莖、同化枝NR、GS、GOGAT、GLDH的活性。

4.2 施N(1.2 g/kg)時(shí)，鹽角草幼苗根、莖、同化枝活體NR活性、莖活體GS、GOGAT活性達(dá)到最大值。

4.3 施N(2.4 g/kg)時(shí)，鹽角草幼苗根、同化枝活體GS、GOGAT活性及根、莖、同化枝活體GLDH活性達(dá)到最大值。