龔林濤，蘇秀娟，尹松松，孫明輝，閆博文，阿迪萊·阿布都熱依木,陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 / 新疆農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052 )

0 引 言

【研究意義】薰衣草為唇形科薰衣草屬(Lavandula)。我國主要栽培的薰衣草種有狹葉薰衣草(LavandulaangustifoliaMil1.)、闊葉薰衣草(LavandulalatifoliaVill.)、雜薰衣草(Lavandulaxintermedia)[1]。新疆是薰衣草的主要種植地區(qū)，薰衣草花穗提取的精油具有抗菌、鎮(zhèn)靜、助眠、緩解疼痛等功效[2]，被廣泛應用于日化用品、化妝品、香薰等領域。薰衣草精油由多種化合物組成，其中萜類化合物占比最高，其主要組分為芳樟醇、乙酸薰衣草酯、乙酸芳樟酯、1,8-桉葉醇、羅勒烯、樟腦等單萜類化合物[3]。植物的萜烯類物質的合成有2個途徑，一個是存在于胞質中的甲羥戊酸(MVA)途徑[4]，另一個是存在于質體上的甲基赤蘚糖醇途徑(MEP)[5]，而單萜類化合物主要由MEP途徑合成[6]。DXS是催化MEP途徑第一步反應的重要限速酶，催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate，DXP)[7]。DXS在植物萜類產(chǎn)物的形成和代謝中起到重要作用。揭示DXS基因在薰衣草萜類物質合成過程中的調控作用，可為利用轉基因技術培育優(yōu)質薰衣草品種提供理論基礎。 【前人研究進展】Jiang R[8]構建可產(chǎn)生擬紫羅蘭酮的菌株時，向大腸稈菌中轉入含有DXS基因的重組質粒，使擬紫羅蘭酮的產(chǎn)量增加了8.34倍。Berry[9]發(fā)現(xiàn)DXS基因轉錄水平與類胡蘿卜素的積累有直接關系，從而影響辣椒的顏色強度。共表達煙草DXS基因和SPS(茄尼基焦磷酸合酶)基因，轉基因植株茄尼醇的含量最高提升了3倍左右，苗期DXS基因表達量最高是對照的10.2倍[10]。Vaccaro等[11]發(fā)現(xiàn)，過表達藍細菌DXS基因可使丹參菌核毛根部產(chǎn)生大量的生物活性二萜，其中衣索酮的產(chǎn)量提高了3倍左右。Wei Hui等[12]將胡楊PtDXS基因導入白楊樹中發(fā)現(xiàn)：相比野生型，轉基因白楊中脫落酸和赤霉素含量較高。DXS基因除具有可以調控萜類代謝的功能，還與植物抗病性有關[13]。 【本研究切入點】DXS基因在萜類合成代謝中具有重要的作用，目前在薰衣草萜類合成代謝過程中的調控作用尚未報道。研究DXS基因分子特性和表達模式，了解其在薰衣草萜類合成代謝過程中的調控作用，揭示其在薰衣草萜類代謝途徑上的分子機理。 【擬解決的關鍵問題】以高油薰衣草品系雜花為材料，克隆并分析DXS基因，比較DXS基因在低油薰衣草品系法國藍和高油薰衣草品系雜花的花器官的時空表達，并對該基因進行原核表達分析。系統(tǒng)分析DXS基因分子特性以及表達特性，研究該基因在薰衣草萜類代謝通路中的調控機制，為培育優(yōu)質薰衣草品種提供優(yōu)異基因資源和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 薰衣草

試驗以新疆伊犁地區(qū)種植的薰衣草品系雜花和法國藍為材料。

1.1.2 載體和試劑

pET-28a(+)、pCAMBIA1304保存于新疆農(nóng)業(yè)大學生物技術重點實驗室；大腸稈菌DH5α感受態(tài)、pEASY-T5 Simple Cloning Kit 、TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase、TransStartTip Green qPCR SuperMix (+Dye I)、ProteinRuler?II、Transetta(DE3)感受態(tài)購自北京全式金生物技術有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；核酸染料、農(nóng)稈菌GV3101感受態(tài)購自北京博邁德生物技術有限公司；2×TaqMaster Mix、MarkerⅦ、Marker 15 000購自北京酷來搏科技有限公司；反轉錄試劑盒、限制性內切酶NdeⅠ、EcoRⅠ、T4DNA 連接酶購自賽默飛世爾科技有限公司；引物合成和測序由昆泰銳生物技術有限責任公司完成。LB培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含胰蛋胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，固體培養(yǎng)基含瓊脂15 g。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆

根據(jù)NCBI公布的狹葉薰衣草1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶核苷酸序列(登錄號：JX630150.1)，設計特異性引物(F1: ATGGCGTCTTGTGGAGTTTT、R1: TTAAGATGACAGGTTGATGAAACG)。提取雜花葉片RNA反轉錄為cDNA作為模板，擴增該目的基因。反應體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2.5 mM dNTPs 5 μL，10×EasyPfuBuffer 5 μL，EasyPfuDNA Polymerase 1 μL，water 36 μL。反應條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收后，用pEASY-T5載體連接，菌液PCR鑒定陽性克隆，送測昆泰銳生物技術有限責任公司。

1.2.2 生物信息學

利用生物信息學網(wǎng)絡平臺NCBI網(wǎng)站提供的Blastp程序對編碼蛋白進行相似性搜索。使用ProtParam在線程序計算編碼蛋白的理化參數(shù)。使用EMBL的InterProScan及Pfam對推導出的蛋白功能結構域進行預測。使用 PSIPRED在線工具預測該蛋白質的二級結構。使用SWISS-Model在線程序的自動模式對該蛋白的三級結構進行預測分析。使用Clustal X和MEGA 5.0完成多種氨基酸序列比對及相關蛋白的同源樹構建。

1.2.3 表達模式

取雜花和法國藍花器官不同發(fā)育時期的花冠：花蕾期、初開期、半開期、盛開期、衰敗期；花器官盛開期的不同組織：花冠、花萼、萼片、雄蕊、雌蕊，提取RNA，反轉錄為cDNA；設計用于表達分析的特異性引物(F2: GCACGATGTGGACCTTCAGA、R2: CCGCCCGGTCCATCA；以β-Actin(F3: TGTGGATTGCCAAGGCAGAGT、R3: AATGAGCAGGCAGCAACAGCA)基因為內參，利用熒光定量PCR技術分析DXS基因在薰衣草不同品系花器官的不同發(fā)育時期及不同組織中的表達模式。

1.2.4 原核表達

設計含有NdeⅠ、EcoRⅠ酶切位點的克隆引物(F4: GGAATTCATATGATGGCGTCTTGTGGAGTTTT、R4: CGGAATTCAGATGACAGGTTGATGAAACG)，酶切擴增產(chǎn)物及pET-28 a(+)載體，瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的基因及線性載體，T4連接酶連接后轉化DH5α，鑒定陽性克隆，送測昆泰銳生物技術有限責任公司，抽提質粒轉化Transetta(DE3)感受態(tài)。活化50 μL pET-28 a(+)-DXS菌液至5 mL LB培養(yǎng)基中37℃，220 r/min，12 h，將活化菌液500 μL加入15 mL LB培養(yǎng)基中至OD600在0.4～0.6，1 mL使用含終濃度0、0.1、0.5、0.8、1、1.5和2 mM IPTG的LB培養(yǎng)基37℃誘導8 h，菌液沉淀使用120 μL去離子水重懸后加入30 μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNAMAN軟件對DXS基因序列進行分析，使用ProtParam在線程序對編碼蛋白的理化參數(shù)進行分析，使用EMBL的InterProScan及Pfam在線預測軟件、PSIPRED在線預測軟件、SWISS-Model在線程序對DXS蛋白結構進行預測，使用Clustal X和MEGA 5.0完成多種氨基酸序列比對及蛋白同源樹構建，使用Excel 2013、GraphPad Prism對DXS基因在雜花、法國藍花器官不同發(fā)育時期、不同組織的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 DXS基因克隆

以薰衣草雜花cDNA為模板，擴增出DXS基因。雜花DXS基因的ORF長2 181 bp，編碼1條由726個氨基酸組成的蛋白質序列。使用ProtParam在線程序計算雜花DXS基因編碼蛋白的理化參數(shù)。研究表明，該蛋白質等電點為6.57，分子量約為78.39 KDa。圖1

注：M：Marker Ⅶ；1：PCR擴增Note: M: Marker Ⅶ; 1: PCR amplification圖1 DXS基因擴增電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DXS gene

該蛋白質序列含有DXP_synthase_N結構域、Transket_pyr和Transketolase_C結構域，預測該蛋白屬于TPP_enzyme超家族成員、Transketolase_C超家族成員。圖2

圖2 DXS蛋白的功能結構域Fig. 2 Conserved domains in DXS protein

DXS蛋白二級結構包含29個β-折疊和20個α-螺旋。使用SWISS-Model在線程序的自動模式對DXS蛋白的三級結構進行預測分析。發(fā)現(xiàn)該蛋白三級結構中含有GCC元件結合結構域(SMTL ID 2o1x.1 B)，相似性達到41.31%以上。圖3

圖3 DXS蛋白二級結構預測Fig. 3 Predicted secondary structure of DXS protein

狹葉薰衣草(Lavandulaangustifolia)、冬凌草(Isodonrubescens)、毛喉鞘蕊花(Plectranthusbarbatus)、一串紅(Salviasplendens)、鼠尾草(Salviaofficinalis)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、野茶樹(Camelliasinensis)、毛花連蕊茶(Camelliafraterna)、獼猴桃 (Actinidiachinensis)、萬壽菊(Tageteserecta)中的DXS蛋白序列具有高度的保守性；構建相關蛋白的同源樹，DXS蛋白和狹葉薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花DXS蛋白親緣關系相近。圖4～6

圖4 DXS蛋白三級結構預測模型
Fig. 4 Predicted 3D structure model of DXS protein

注：圖中分支點的數(shù)值表示Bootstrap 驗證中基于1 000次重復的置信度Note: The numerical values of the branch points in the graph represent the confidence of the bootstrap validation based on 1,000 repetitions圖5 DXS蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of DXS protein

圖6 雜花DXS蛋白與其他物種DXS蛋白序列比對Fig. 6 Multiple alignment of amino acid sequences of DXS protein in Zahua

2.2 DXS基因的表達模式

研究表明，在2個品系花器官的不同發(fā)育時期和不同組織中均檢測到了DXS基因的表達。

DXS基因在雜花花蕾期、初開期的表達量差異不顯著(P>0.05)，初開期、半開期、盛開期、衰敗期花冠表達量呈現(xiàn)顯著遞增的趨勢；在法國藍花蕾期、初開期、半開期、盛開期4個時期表達量不斷上升，盛開期達到最高，衰敗期開始降低。DXS基因在雜花花萼中表達量最高，在法國藍盛開期雄蕊中表達量最高。圖7，圖8

圖7 DXS基因在雜花和法國藍花器官不同發(fā)育時期表達量Fig. 7 Expression analysis of DXS gene in Zahua and French Blue flower organs at different developmental stages

DXS基因在雜花和法國藍花器官不同發(fā)育時期、不同組織相對表達量也存在差異。DXS基因在雜花不同發(fā)育時期的表達量均高于該基因在法國藍不同發(fā)育時期的表達量；DXS基因在雜花的花冠、花萼、萼片的表達量均高于該基因在法國藍以上組織中的表達量，而該基因在雄蕊、雌蕊中的表達量均低于在法國藍中的表達量，DXS基因在雜花和法國藍花器官不同發(fā)育時期、不同組織中的表達模式存在差異。圖7，圖8

圖8 DXS基因在雜花和法國藍花器官不同組織中表達量Fig. 8 Expression analysis of DXS gene in Zahua and French Blue flower organs at different tissues

2.3 DXS基因原核表達

EcoRⅠ、NdeⅠ 酶切鑒定構建的pET-28a(+)-DXS重組質粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切后的小片段條帶大小與目的基因大小一致，回收小片段產(chǎn)物后測序結果與目的序列一致，證明載體構建成功。將pET-28a(+)-DXS、pET-28a(+)空載體轉化Transetta(DE3)感受態(tài)細胞，通過對不同時間、不同溫度、不同誘導劑濃度的篩選進行表達體系優(yōu)化，在37℃，誘導4 h，誘導劑IPTG濃度為0.8 mM時誘導量最大。圖9,圖10

注：M：Marker 15 000；1：pET-28a(+)-DXS質粒經(jīng)NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切；2：pET-28a(+)-DXS線性質粒Note: M: Marker 15,000; 1: pET-28a(+)- DXS digested by double enzyme NdeⅠ and EcoRⅠ;2: pET-28a(+)-DXS Linear plasmid圖9 原核表達載體 pET-28a(+)-DXS雙酶切鑒定Fig. 9 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

注：M：蛋白ProteinRuler Ⅰ ；1：pET-28a(+)未誘導；2：pET-28a(+)誘導后；3：pET-28a(+)-DXS蛋白誘導前；4：DXS蛋白未誘導；5：DXS蛋白誘導后Note: M: ProteinRuler Ⅰ; 1: Transetta with pET-28a(+) uninduced; 2: Transetta with pET-28a(+) induced by IPTG; 3: Transetta with pET-28a(+)-DXS before induction; 4: Transetta with pET-28a(+)-DXS uninduced; 5: Transetta with pET-28a(+)-DXS by IPTG圖10 DXS重組蛋白原核表達Fig.10 Prokaryotic expression analysis of recombinant DXS protein

3 討 論

DXS作為催化MEP途徑第1步反應的重要限速酶，在植物萜類代謝中起到至關重要的作用，對DXS基因家族的研究引起了廣泛關注。研究表明，不同植物中DXS基因家族成員的數(shù)目各不相同，如雷公藤有2個DXS基因，沉香和擬南芥有3個DXS基因[14-15]，胡蘿卜(Daucus carota)[16]有5個DXS基因，煙草僅在茄尼醇合成途徑上就發(fā)現(xiàn)6個DXS基因[17]。研究目前僅從雜花薰衣草中克隆出1條DXS基因。

近10年來約有200個植物的DXS基因相繼被國內外學者克隆，并對DXS基因的基因序列和蛋白結構進行了分析。研究中雜花DXS基因的蛋白含有726個氨基酸，與報道中大多數(shù)植物的DXS蛋白含有691～738個氨基酸的結論一致[18]。雜花薰衣草的DXS蛋白結構高度保守，其對應編碼的氨基酸序列與已登錄NCBI的狹葉薰衣草DXS氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，雜花DXS在第510個氨基酸處多出1個脯氨酸，且雜花DXS全序列共有8處氨基酸序列存在差異。雜花的DXS與大多數(shù)植物DXS具有相同的特點，蛋白系統(tǒng)進化樹分析表明，雜花的DXS蛋白與狹葉薰衣草DXS蛋白一致性最高，其次與唇形科香茶屬的冬凌草、唇形科鞘蕊屬毛喉鞘蕊花的DXS蛋白也有較高的一致性，而與菊科萬壽菊屬的萬壽菊DXS蛋白一致性最低，DXS同源蛋白序列間的差異，可能使其在不同物種中行使不同的生物功能。根據(jù)PredictProtein、TargetP蛋白在線預測軟件預測，亞細胞定位預測雜花DXS蛋白定位在葉綠體上，這與MEP途徑位于質體上的報道一致。

DXS基因表達水平與品種有關，并具有組織差異性[19]。張浩宇等[20]發(fā)現(xiàn)DXS基因在香味越濃的百合品種中表達量越高；徐燕[21]發(fā)現(xiàn)5個不同茶樹品種葉芽中的DXS基因的表達量也有差異。Xu Chen等[22]在木本植物胡楊中發(fā)現(xiàn)，PtDXS在葉片中表達水平最高，在根中表達水平最低，烏頭[23]中AbDXS1基因，熊膽草[24]中CbDXS基因在葉片中的表達水平也高于在根中的表達水平。王輝等[25]發(fā)現(xiàn)，紅豆杉中的TcDXS在嫩葉柄表達最高，葉、皮次之，根、莖最低。DXS基因表達水平與組織發(fā)育程度也有關系，郭亞飛[26]發(fā)現(xiàn)，茶樹CsDXS1基因在葉片的不同發(fā)育時期存在表達差異，嫩葉中表達水平更高；鄭麗屏等[27]發(fā)現(xiàn)，黃花蒿DXS基因的表達水平花期植株顯著高于營養(yǎng)期植株。研究中，DXS基因在雜花、法國藍2品系中不同發(fā)育時期、不同組織中均有表達；在衰敗期雜花的表達量呈現(xiàn)上升的趨勢，法國藍的表達量呈現(xiàn)下降的趨勢；而從DXS基因在雜花不同發(fā)育時期、不同組織的表達量均高于法國藍，初步判斷DXS基因表達與薰衣草精油產(chǎn)量存在正相關關系。

DXS基因家族中每一條DXS可能僅作用于一個或幾個萜類成分的生物合成途徑，如Fangyuan Z 等[28]從青蒿中克隆DXS基因(AaDXS1、AaDXS2、AaDXS3)，發(fā)現(xiàn)AaDXS2在特定組織中的表達模式與青蒿素合成的表達模式相似，并推測AaDXS2是合成青蒿素途徑中的唯一一個DXS家族成員。據(jù)報道，DXS基因對薰衣草萜類成分合成途徑存在影響，Isabel[29]通過轉化寬葉薰衣草，將DXS基因與催化MEP途徑第2步的關鍵酶基因DXR(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶)的功能進行比較，證明了DXS基因對萜類成分合成途徑的調控作用更為明顯；擬南芥DXS基因導入寬葉薰衣草基因組后發(fā)現(xiàn)轉基因植株葉片和花朵中精油產(chǎn)量比對照顯著提高[30]。

利用原核體外表達進行基因功能的驗證具有操作簡單、周期短的優(yōu)點。馮國慶[31]對紫杉醇的TCDXS基因構建了原核表達載體，并成功在Transetta (DE3)中表達。Wei Hui等[12]將PtDXS重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達純化后進行活性評價，結果表明，純化后的蛋白能夠催化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)。研究構建了薰衣草DXS基因原核表達載體，并成功進行了誘導，但是由于大腸桿菌的密碼子偏好性，外源基因DXS在Transetta中表達量不高，且容易降解。研究成功誘導得到含有組氨酸標簽的DXS蛋白，為后期該蛋白的純化和復性打下基礎，也是構建體外酶活體系鑒定雜花薰衣草DXS蛋白功能的前提。

4 結 論

DXS基因表達量與薰衣草精油產(chǎn)量存在正相關關系，薰衣草DXS基因可能是調控薰衣草萜類代謝物合成的限速酶；建立了DXS基因的原核表達系統(tǒng)。