李靜靜，孫 勇，張素梅

1.安徽公安職業(yè)學(xué)院公安科學(xué)技術(shù)系，安徽合肥,230031;2.合肥市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，安徽合肥,230061;3.安徽醫(yī)科大學(xué)生化教研室，安徽合肥,230032

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率增長迅速，對人群健康和生命造成嚴重威脅[1]。近半個世紀來，肺癌的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)均呈上升趨勢，尤其是在發(fā)達國家。肺癌的病死率也呈逐年上升的趨勢，在男性中肺癌位居男性癌癥死因首位[2]。當(dāng)傳統(tǒng)的手術(shù)切除腫瘤、放化療等方法達不到預(yù)期療效時，越來越多的學(xué)者開始積極探索靶向治療、免疫治療以及高壓氧等其他輔助治療措施的使用。

研究表明，腫瘤細胞在體內(nèi)是處于缺氧狀態(tài)的，實體瘤因其迅速生長而導(dǎo)致實體瘤組織內(nèi)氧供不足，造成缺氧微環(huán)境[3]。實體瘤所處的缺氧微環(huán)境會影響腫瘤細胞中一些基因的表達，包括表達和激活新生血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子等，進而促進腫瘤新生血管的生成。同時，缺氧環(huán)境也會導(dǎo)致腫瘤細胞過度表達和激活眾多的促腫瘤生存因子，使腫瘤細胞惡性程度增加，促進腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力，并引起腫瘤細胞對化療和放療的耐受和抵抗[4]。那么能否通過破壞腫瘤細胞體內(nèi)的缺氧微環(huán)境達到對腫瘤細胞的抑制甚至滅活？高壓氧可以增加腫瘤的氧氣灌注，從而改變腫瘤的缺氧微環(huán)境，這種高壓狀態(tài)下施用的氧氣還能夠阻礙腫瘤細胞的脫氧核糖核酸合成，引起脫氧核糖核酸損傷并抑制細胞的分裂[5]。

國際上常用二氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)腫瘤細胞缺氧環(huán)境。CoCl2抑制脯氨酸羥化酶的羥化作用，阻礙氧信號的傳導(dǎo)，同時鈷離子能夠競爭血紅蛋白成分中的亞鐵離子，阻礙形成氧合血紅蛋白，降低血液攜氧能力，從而誘發(fā)細胞缺氧的系列癥狀[6]。此次實驗中首先用CoCl2處理肺癌A549細胞，模擬腫瘤細胞缺氧微環(huán)境，再用高壓氧進行處理。細胞劃痕實驗觀察A549細胞經(jīng)過處理后遷移能力的變化，同時Western blot檢測JNK、p-JNK蛋白表達情況，初步探討其可能的分子機制，為治療或緩解肺癌提供一個新的方案或思路。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人肺癌細胞A549為本實驗室保存，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37℃、飽和濕度。

1.2 細胞分組情況

將A549細胞分為4組：細胞對照組(cell)、CoCl2處理組(CoCl2)、高壓氧處理組(HBO)、CoCl2和高壓氧處理組(CoCl2+HBO)。

1.3 主要試劑及儀器

二氯化鈷(CoCl2)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)和二甲亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司；1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Clark Bioscience公司；BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自美國 Pierce公司；抗人β-actin、JNK和p-JNK特異性抗體均購自美國SantaCruz公司，辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Millipore公司；增強ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國 Thermo Scientific公司。高壓氧艙(山東煙臺，GY3600)；倒置顯微鏡(Leica DMI 3000B);電泳儀(北京六一儀器廠，DYYTC)。

1.4 高壓氧處理

將處于對數(shù)生長期的細胞進行如下高壓氧處理，每天一次，總共兩次。高壓氧艙每次紫外線消毒15 min，并純氧洗艙。細胞在無菌條件下平放進行高壓吸氧90 min分鐘，其中15 min升壓，60 min恒壓，15 min減壓。在此過程中，HBO室的氧氣流量為2 L/min。高壓氧處理后細胞繼續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)法檢測細胞增殖情況

待培養(yǎng)瓶中的A549細胞長到80%～90%密度時，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3遍，用0.25%胰酶1 mL消化細胞，加入1 mL完全1640培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打使成為單細胞懸液后，吸取合適體積置于細胞計數(shù)板上細胞計數(shù)，用含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×107/L，然后將細胞懸液種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔種植200 μL細胞懸液。待細胞貼壁，次日小心吸盡96孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，加入含有不同濃度CoCl2(50、100、200、300 μM)的完全1640培養(yǎng)液，同時設(shè)細胞對照組、DMSO對照組，在37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h。向每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，將96孔細胞培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃溫育4 h后，小心棄去上清液，控干。向每孔中加入100 μL DMSO，將96孔培養(yǎng)板放于恒溫振蕩器中37 ℃振蕩10 min，以徹底溶解細胞培養(yǎng)板中的結(jié)晶物，然后用酶標儀檢測每孔的吸光度值(OD值)，設(shè)定波長為570 nm。抑制率計算公式為：抑制率%=(對照孔OD570-實驗孔OD570)/對照孔OD570× 100%。細胞增殖實驗結(jié)果為3次獨立實驗的平均值，實驗中每組設(shè)6個復(fù)孔。根據(jù)不同濃度CoCl2對細胞增殖的抑制情況選取合適的CoCl2進行以下實驗。

1.6 細胞劃痕實驗檢測肺癌細胞遷移能力

將肺癌A549細胞接種至兩塊6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長滿后，用無菌槍頭在單層細胞底部中央位置劃出“十”字劃痕，小心吸棄培養(yǎng)基后，用無菌PBS小心洗去死細胞，顯微鏡下拍照，記為“0 h”。加入新鮮培養(yǎng)基并將兩塊6孔細胞培養(yǎng)板分別給予不同處理，每塊6孔培養(yǎng)板中的細胞都被分為細胞對照組和CoCl2(50 μM)處理組，其中一塊6孔板同時給予每天一次HBO處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后分別觀察細胞生長情況并在顯微鏡下拍照記為“24 h”“48 h”。用Quantity One軟件分別測量0 h、24 h和48 h的細胞劃痕邊界之間的距離，0 h的距離減去24 h或48 h的距離即為24 h或48 h的細胞遷移距離。

1.7 Western Blot檢測蛋白表達

經(jīng)上述處理(處理方法同細胞劃痕實驗)的各組A549細胞，用PBS洗3遍，每瓶加入300 μL RIPA蛋白裂解液，冰上放置30 min后用細胞刮子充分刮下細胞并吸取轉(zhuǎn)移至標1.5 mL EP管中。為使細胞充分裂解，將收取的細胞裂解液放置于-80 ℃冰箱，完全冷凍后取出放于4 ℃融解，如此反復(fù)凍融3次后用4 ℃高速冷凍離心機在14 000 r / min轉(zhuǎn)速下離心30 min。吸取離心后的細胞裂解上清液，轉(zhuǎn)移至新的EP管中。用BCA 蛋白定量試劑盒對每組細胞裂解上清液的總蛋白進行定量并計算蛋白濃度，用RIPA蛋白裂解液調(diào)整所有蛋白樣品的濃度為同一濃度，加入蛋白上樣緩沖液并充分混勻，將各管放于沸水中10 min，冷卻后每組取等量的蛋白樣品上樣至12.5%濃度的聚丙烯酰胺進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，用p-JNK、JNK、β-actin的抗體4 ℃下孵育過夜。用含0.05% Tween-20的TBS洗滌3次以去除非特異結(jié)合的抗體，每次洗滌10 min，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。用TBS充分洗膜后，用ECL發(fā)光試劑盒顯影獲取對應(yīng)的特異性條帶。用Quantity One軟件測定各特異性條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參照，分別計算p-JNK、JNK的相對灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，p<0.05為差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度的CoCl2對肺癌A549細胞增殖的影響

MTT結(jié)果表明，隨著CoCl2濃度的增高，抑制率有逐漸上升的趨勢。除50 μM組細胞抑制率為24%，其他組別均大于30%(圖1)。因此選取50 μM為此后CoCl2的實驗濃度。

2.2 高壓氧對缺氧肺癌細胞遷移能力的影響

與細胞對照組相比，單獨CoCl2處理促進細胞遷移，單獨高壓氧處理明顯抑制細胞遷移，CoCl2缺氧處理后高壓氧處理可以逆轉(zhuǎn)CoCl2促進A549細胞遷移的能力(圖2)。

圖2 不同處理對A549細胞遷移能力的影響與細胞對照組相比*p<0.05，與CoCl2組相比#p<0.05

2.3 CoCl2、高壓氧處理對A549細胞內(nèi)JNK、p-JNK表達的影響

相對于細胞對照組，單獨CoCl2處理組p-JNK表達量上升，高壓氧單獨處理組p-JNK表達量降低。而CoCl2和高壓氧共同處理組相較于細胞對照組和單獨CoCl2處理組p-JNK表達量也降低,見圖3。

圖3 不同處理對A549細胞JNK、p-JNK蛋白表達的影響與細胞對照組相比*p<0.05，與CoCl2組相比#p<0.05

3 討 論

過度無限制的增殖是腫瘤細胞的主要特征之一，腫瘤細胞的快速增殖使腫瘤細胞處于一個持續(xù)的相對低氧狀態(tài)的微環(huán)境，而腫瘤細胞為應(yīng)對這種低氧狀態(tài)而進行的一系列基因表達和代謝的變化又進一步促進腫瘤細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移能力[7]。高壓氧療法(HBO)是一種被廣泛應(yīng)用于臨床治療的有效方法，包括一氧化碳中毒、顱腦損傷、軟組織嚴重感染壞死和減壓病等疾病。已有眾多研究證實，HBO有化療或者放療增敏作用，可與化療或者放療聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療，是一種能有效增強其他治療方法效果的輔助治療方法[8]。本研究探討HBO的聯(lián)合抗腫瘤作用是否與緩解腫瘤細胞缺氧所致的腫瘤惡性程度增加和轉(zhuǎn)移能力增強有關(guān)。

通過不同處理組細胞遷移結(jié)果看，單獨CoCl2誘導(dǎo)缺氧組遷移距離較正常細胞組增加，說明體內(nèi)缺氧微環(huán)境增加了A549細胞的不穩(wěn)定性，促進其遷移擴散。施加高壓氧處理后，細胞遷移距離明顯縮短，說明高壓氧抑制了缺氧微環(huán)境下的肺癌A549細胞的遷移甚至擴散。

高壓氧抑制缺氧的肺癌A549細胞遷移是本試驗中最直觀的結(jié)果，用Western blot檢測JNK磷酸化水平的變化以進一步探討高壓氧抑制缺氧肺癌A549細胞的遷移的可能分子機制。絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族信號通路在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，其重要成員之一c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminlki-nase，JNK)，可參與調(diào)控細胞對內(nèi)源和外源應(yīng)激因素的反應(yīng)，因此也被稱為應(yīng)激激活蛋白激酶。JNK信號通路可被眾多刺激物激活，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[9]。近年來,已在宮頸癌、肝癌、星形細胞瘤、前列腺癌、乳腺等多種腫瘤發(fā)現(xiàn)了JNK異常表達[10-14]。在本實驗中，CoCl2處理后的A549細胞JNK的磷酸化水平升高，而高壓氧則降低JNK的磷酸化水平。

就目前的實驗結(jié)果可以看出，缺氧微環(huán)境下肺癌細胞A549遷移能力增加，進行高壓氧處理可以抑制其遷移能力，且缺氧狀態(tài)下肺癌細胞A549的JNK磷酸化水平增加，高壓氧可以降低其JNK的磷酸化水平。但是高壓氧逆轉(zhuǎn)缺氧對肺癌細胞A549的作用是否還有其他信號通路的調(diào)節(jié)，JNK通路具體發(fā)揮怎樣的作用還有待進一步的研究。