石玉祥，趙文鵬，劉 洋，劉 鋼，楊 峰，高 健，韓 博

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193 ； 2.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056038 ； 3.貴陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽(yáng) 550081)

奶牛乳房炎是奶牛常見(jiàn)多發(fā)的疾病之一，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在引發(fā)奶牛乳房炎的病原菌中，革蘭陰性菌(如大腸桿菌和克雷伯桿菌)和陽(yáng)性菌(如金黃色葡萄球菌和鏈球菌)是主要的致病菌[1-2]。在導(dǎo)致奶牛乳房炎的革蘭陰性菌中，大腸桿菌和克雷伯桿菌為最常見(jiàn)的致病菌[3-4]。肺炎克雷伯桿菌作為一種環(huán)境性致病菌，通?？稍陴B(yǎng)牛場(chǎng)的墊料、污水、動(dòng)物體表和糞便中分離到。奶牛肺炎克雷伯桿菌性乳房炎常發(fā)生在母牛泌乳期，此期發(fā)病的奶牛不但造成其產(chǎn)奶量降低和奶品質(zhì)下降，而且嚴(yán)重時(shí)還造成急性死亡[5]。目前，針對(duì)肺炎克雷伯桿菌引發(fā)的奶牛乳房炎的主要治療措施是抗生素療法，但此療法往往存在著預(yù)后不佳和反復(fù)發(fā)作的問(wèn)題，且易造成肺炎克雷伯桿菌嚴(yán)重的耐藥性。因此，深入研究奶牛乳房炎源性克雷伯桿菌的致病性和耐藥性，為奶牛乳房炎的防治以及篩選和開(kāi)發(fā)新型替抗產(chǎn)品提供策略。本試驗(yàn)對(duì)樣品中肺炎克雷伯桿菌進(jìn)行分離鑒定和耐藥性檢測(cè)，為研究奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的生物學(xué)特性和致病性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 2017年12月-2018年12月，在河北某大型奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)無(wú)菌采集臨床型奶牛乳房炎牛奶樣品共計(jì)245份，用于肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定。肺炎克雷伯菌ATCC700603，購(gòu)自溫州康泰生物科技公司。

1.2 主要試劑 LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯、腦心浸液(BHI)和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片，購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；脫脂綿羊血和革蘭染色試劑盒，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR Super Mix，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA Marker，購(gòu)自北京華佰泰生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離和純化培養(yǎng) 將試驗(yàn)所需的滅菌棉簽和TSA血平板于超凈工作臺(tái)中紫外照射20 min，用棉簽蘸取適量的奶樣在TSA血平板上劃線接種，該平板記為P1板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h。取出 P1平板置于超凈臺(tái)，用滅菌的接種環(huán)挑取P1平板中單個(gè)菌落，利用四區(qū)劃線法接種血平板，該平板記為P2板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h。

1.4 細(xì)菌的革蘭染色鏡檢 參照革蘭染色試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，并進(jìn)行染色結(jié)果判定。根據(jù)染色后菌體的顏色將細(xì)菌分為2類：染色結(jié)果為藍(lán)色的細(xì)菌通常為革蘭陽(yáng)性菌株，染色結(jié)果為紅色的通常為革蘭陰性菌株。

1.5 細(xì)菌的生化鑒定 對(duì)鏡檢結(jié)果為陰性的細(xì)菌進(jìn)行觸媒試驗(yàn)，若有產(chǎn)氣反應(yīng)(即H2O2液滴有氣泡翻滾)，則記為觸酶陽(yáng)性，無(wú)反應(yīng)者記為觸酶陰性。挑取疑似菌株單菌落接種于生化管內(nèi)，用封口膜將管口封閉，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。根據(jù)腸桿菌科生化鑒定手冊(cè)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)判定。

1.6 細(xì)菌的DNA鑒定 將細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)至平臺(tái)生長(zhǎng)期，吸取2 mL菌液，12 000 r/min離心3 min，棄去上清液獲得細(xì)菌，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。設(shè)計(jì)合成引物，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，對(duì)疑似菌株16S rRNA 基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳試驗(yàn)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL：1 μL DNA模板，上、下游引物(10 mol/L)各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL和ddH2O 7 μL，混勻之后瞬時(shí)離心。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s,72℃ 90 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，擴(kuò)增結(jié)束后4 ℃保存。將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，待電泳結(jié)束后，通過(guò)Alpha Imager EC凝膠成像儀觀察電泳凝膠，拍照記錄結(jié)果。

1.7 紙片擴(kuò)散法檢測(cè)細(xì)菌的藥物敏感性 將新鮮的菌液加到LB固體培養(yǎng)基上并涂均勻，待其干燥后，將藥敏片貼在LB固體培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基放置5個(gè)藥敏片。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用直尺測(cè)量抑菌圈的直徑，記錄數(shù)據(jù)，每種藥物做3個(gè)平行試驗(yàn)。依照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI) 2014版[6]執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：敏感(S)，中介(I)和耐藥(R)。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯桿菌的菌落形態(tài)特征 分離獲得的細(xì)菌在LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h，可見(jiàn)菌落呈現(xiàn)出圓潤(rùn)、光滑和表面凸起的形態(tài)(見(jiàn)中插彩版圖1A)。經(jīng)脫脂纖維綿羊血TSA培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，可觀察到菌落形態(tài)呈現(xiàn)出大小2 mm左右、圓形且表面濕潤(rùn)的特征(見(jiàn)中插彩版圖1B)，均符合肺炎克雷伯桿菌的菌落特征。革蘭染色顯示，該疑似菌株革蘭染色呈紅色，為革蘭陰性菌，且該菌落形態(tài)為桿狀或短棒狀(見(jiàn)中插彩版圖1 C1和C2)，符合肺炎克雷伯桿菌的形態(tài)特征。此外，對(duì)分離株進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，結(jié)果均為觸酶陽(yáng)性，提示分離株為革蘭陰性菌。

2.2 肺炎克雷伯桿菌的生化鑒定 將分離的細(xì)菌接種于腸桿菌科微量編碼生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h后，葡萄糖顏色由紫色變成白色，賴氨酸由暗紅色變?yōu)闇\紫色，鳥(niǎo)氨酸由棕色變?yōu)闇\棕色，衛(wèi)茅醇由紫色變?yōu)闊o(wú)色，尿素由黃色變?yōu)闇\黃色且有氣泡生成。疑似菌株在葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、衛(wèi)茅醇和尿素生化管中均呈陽(yáng)性；在硫化氫、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸櫞酸鹽生化管均呈陰性。通過(guò)將以上生化結(jié)果與腸桿菌科生化鑒定手冊(cè)比對(duì)分析可知，該細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果符合肺炎克雷伯桿菌的生化特征。

2.3 肺炎克雷伯桿菌的分子鑒定 提取細(xì)菌基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，將45株疑似菌株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，疑似菌株可擴(kuò)增出大小一致的條帶，且與目的條帶大小相符合，約為1 500 bp，如圖2所示，這與肺炎克雷伯桿菌的基因組大小一致。

圖2 部分疑似肺炎克雷伯桿菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR amplification products of suspected Klebsiella pneumoniaeM：DNA Marker； 1～16：部分離菌株的PCR產(chǎn)物條帶； 17：肺炎克雷伯桿菌PCR產(chǎn)物條帶M:DNA Marker; 1～16:PCR product band of partial isolates;17:PCR products of Klebsiella pneumoniae

2.4 肺炎克雷伯桿菌的耐藥性檢測(cè) 分離獲得的肺炎克雷伯桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。肺炎克雷伯桿菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、慶大霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，提示本次分離獲得的肺炎克雷伯桿菌耐藥性嚴(yán)重；對(duì)頭孢氨芐、卡那霉素和頭孢喹肟的敏感率分別為60%、46.7%和44.4%。

表1 肺炎克雷伯桿菌的耐藥性分析Table 1 Drug resistance analysis of Klebsiella pneumoniae

3 討論

通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和PCR擴(kuò)增試驗(yàn)確認(rèn)分離菌株為肺炎克雷伯桿菌；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，肺炎克雷伯桿菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、慶大霉素和克林霉素的耐藥率分別為73.3%、53.3%、48.9%和46.6%，對(duì)頭孢氨芐、卡那霉素和頭孢喹肟3種藥物敏感。

奶牛乳房炎是由革蘭陰性菌和革蘭陽(yáng)性菌感染乳腺上皮細(xì)胞引起的乳腺疾病。在臨床型奶牛乳房炎中，由病原菌感染引發(fā)的乳房炎嚴(yán)重影響產(chǎn)奶量、乳品質(zhì)以及增加治療成本和死淘率，給乳制品行業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[7]。肺炎克雷伯桿菌是一種常見(jiàn)的環(huán)境性致病菌，針對(duì)該菌引發(fā)的奶牛乳房炎通常采用抗生素進(jìn)行治療，長(zhǎng)期使用抗生素導(dǎo)致病原菌耐藥、藥物殘留和肉奶品質(zhì)安全等問(wèn)題日益突出[8-9]。本試驗(yàn)通過(guò)采集臨床型乳房炎患病奶牛的乳樣，對(duì)奶樣中的肺炎克雷伯桿菌進(jìn)行分離鑒定以及耐藥性分析，為進(jìn)一步研究奶牛乳房炎性肺炎克雷伯桿菌的致病性提供依據(jù)。

本試驗(yàn)分離獲得的45株疑似肺炎克雷伯桿菌菌株在培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出灰白色、黏液狀、光滑、灰白色與粉紅色交錯(cuò)、形態(tài)大小一致的菌落，這與張超等[10]報(bào)道的肺炎克雷伯桿菌的菌落形態(tài)特征相似。經(jīng)革蘭染色鏡檢觀察，發(fā)現(xiàn)疑似菌株革蘭染色為紅色，表明該菌為革蘭陰性菌，其形態(tài)呈現(xiàn)出單個(gè)、成雙或短鏈狀排列、短棒狀或桿狀的特征，這與Lin等[11]報(bào)道的肺炎克雷伯桿菌形態(tài)特征相符合。該疑似菌株的觸酶試驗(yàn)結(jié)果顯示均有氣泡產(chǎn)生，這也進(jìn)一步表明本試驗(yàn)分離的疑似菌株為革蘭陰性菌。肺炎克雷伯桿菌屬于腸桿菌科，具有獨(dú)特的生物化學(xué)特性。生化結(jié)果顯示，疑似菌株可分解葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、衛(wèi)茅醇和尿素；對(duì)硫化氫、蛋白胨水、乳糖、苯丙氨酸和枸櫞酸鹽則不分解，與腸桿菌科生化鑒定手冊(cè)比對(duì)分析可知，分離株生化鑒定結(jié)果符合肺炎克雷伯桿菌的生化特征，且這與林雅等[12]分離出的牛源肺炎克雷伯桿菌生化結(jié)果基本一致。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)病原菌的檢測(cè)方法也從細(xì)菌的表型觀察逐漸向病原菌的遺傳生物學(xué)特征鑒定轉(zhuǎn)變，一些敏感性高、特異性強(qiáng)的分子快速檢測(cè)生物學(xué)技術(shù)(如PCR)在病原菌的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，分離株DNA片段大小與目的菌株條帶大小一致，提示所獲得的45株分離株為肺炎克雷伯桿菌。通過(guò)分析總結(jié)以上結(jié)果可知，本試驗(yàn)分離所得的45株細(xì)菌為肺炎克雷伯桿菌，分離率為18.4%，表明河北地區(qū)奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯桿菌的流行率比較高。

抗生素在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，但由此造成的細(xì)菌耐藥和藥物殘留等問(wèn)題日益突出，也成為當(dāng)今眾多國(guó)家公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域最為嚴(yán)重的問(wèn)題之一。近年來(lái)，肺炎克雷伯桿菌的耐藥情況變的愈發(fā)嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)多重耐藥的現(xiàn)象[13-14]。本試驗(yàn)對(duì)分離所得的45株肺炎克雷伯桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌對(duì)青霉素的耐藥達(dá)到70%以上，對(duì)四環(huán)素、克林霉素、氨芐西林和慶大霉素的耐藥率在40%～55%，對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟和卡那霉素3種藥物敏感，這與王樂(lè)等[15]的報(bào)道有區(qū)別。細(xì)菌耐藥性的不同與獲得病原菌的地域、季節(jié)和牛場(chǎng)管理模式以及牛場(chǎng)日常用藥等有密切關(guān)系，而且同一種屬細(xì)菌對(duì)相同藥物的耐藥性也存在一定差異。本試驗(yàn)結(jié)果表明，從臨床型乳房炎患牛奶樣中分離的肺炎克雷伯桿菌表現(xiàn)出嚴(yán)重的耐藥性，說(shuō)明了河北地區(qū)引起奶牛乳房炎的肺炎克雷伯桿菌的耐藥性問(wèn)題比較嚴(yán)重，尋求新型替抗產(chǎn)品治療肺炎克雷伯桿菌引起的奶牛乳房炎迫在眉睫。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)從細(xì)菌的菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征、生化特性和分子遺傳學(xué)特征等方面對(duì)分離疑似菌株進(jìn)行鑒定，確定分離45株細(xì)菌屬于肺炎克雷伯桿菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的肺炎克雷伯桿菌具有嚴(yán)重的耐藥性，為河北省肺炎克雷伯桿菌引發(fā)的奶牛乳房炎防治提供科學(xué)理論依據(jù)。