胡亦懿 翟英姬 梅迪華 杜國(guó)平（通訊作者）

(1 南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院< 佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院>VlP 醫(yī)學(xué)中心 廣東 佛山 528308）（2 南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院< 佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院> 消化內(nèi)科 廣東 佛山 528308）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是最常見的慢性肝病，其特征在于脂肪變性和脂質(zhì)沉積[1-2]。NAFLD 可從單純性脂肪變性、肝內(nèi)脂肪積聚，到更具侵襲性的非酒精性脂肪性肝炎（NASH），NASH 可進(jìn)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌（HCC），目前，NAFLD的發(fā)病率急劇增加[3]，且發(fā)病機(jī)理仍不清楚[4]。研究已表明miRNA-34a 在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪肝中增加，其通過靶向Sirt1參與膽固醇代謝失調(diào)，且miR-34a在NAFLD中呈現(xiàn)高表達(dá)[5]。但miR-34a 在NAFLD 中脂質(zhì)堆積和炎癥中的作用尚不清楚。本研究探討抑制miR-34a 對(duì)NAFLD 細(xì)胞模型中的脂質(zhì)蓄積和炎癥的影響。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肝細(xì)胞HL-7702（L02）細(xì)胞系購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco，CA）和1%青霉素-鏈霉素（北京索萊寶生物科技有限公司）的RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone，UT，美國(guó)）中，于37℃，5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%后用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-34a 抑制劑和陰性對(duì)照（NC 抑制劑）購(gòu)自廣州銳博生物，用Lipofectamine?2000（Invitgen，MA，USA）按制造商說明用50pmol/mL miR-34a 抑制劑和NC 抑制劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24h，將L02 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種到6 孔板中，6h 后更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 ～48h 后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 NAFLD 細(xì)胞模型的建立

誘導(dǎo)NAFLD 細(xì)胞模型，L02 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用油酸（OA；Sigma，USA）1mM 處理24h。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，將L02 細(xì)胞分為空白組、油酸（OA）組、NC 抑制劑+OA（NC+OA）組和miR-34a-抑制劑+OA（抑制劑+OA）組。

1.4 油紅O 染色

OA 處理24h 后，用PBS 沖洗細(xì)胞3 次，4%多聚甲醛固定10min。L02 細(xì)胞油紅O 染色30min。隨后，用蘇木素反復(fù)染色2～3min，用1%鹽酸酒精（快速）進(jìn)行分化。然后在光學(xué)顯微鏡（Olympus Corporation）下觀察。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)

RT-qPCR 常規(guī)檢測(cè)TNF-α、IL-10、IL-6 mRNA 表達(dá)。使用Bulge-Loop ? miRNA RT-qPCR 引物和Bulge-Loop ?miRNA RTqPCR 檢測(cè)試劑盒（RiboBio）在42℃ 60min 和70℃ 10min 進(jìn)行RT。在95℃ 10min、95℃ 2s、60℃ 20s、70℃ 10s，40 個(gè)循環(huán)下進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量，β-actin 作為內(nèi)參，記CT 值，采用2-??CT分析相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），單因素方差分析確定結(jié)果是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 抑制miR-34a 對(duì)NAFLD 細(xì)胞模型中脂質(zhì)蓄積的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，miR-34a 抑制劑組的miR-34a 表達(dá)量顯著低于空白組（圖1A）。油紅O 染色結(jié)果顯示油酸（OA）組和NC+OA 組的油紅O 染成紅色的脂滴數(shù)量均顯著高于空白組，抑制劑+OA 組的油紅O 染色結(jié)果顯著低于NC+OA 組（圖1B）。

圖1 miR-34a 表達(dá)及油紅O 染色結(jié)果

2.2 抑制miR-34a 對(duì)NAFLD 細(xì)胞模型中炎性細(xì)胞因子的影響

結(jié)果顯示，OA組較空白組TNF-α、IL-6 mRNA水平顯著升高，IL-10 mRNA 水平顯著降低（P＜0.01）；miR-34a 抑制劑+OA 組TNF-α、IL-6 mRNA 水平較NC+OA 組顯著降低，IL-10 mRNA 水平較NC+OA 組顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 細(xì)胞模型TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA 水平

3.討論

NAFLD 被認(rèn)為是最嚴(yán)重的慢性肝功能障礙，NASH 是NAFLD的炎癥狀態(tài)，大約三分之一的NAFLD 會(huì)患上NASH，NAFLD 除了增加患肝病的風(fēng)險(xiǎn)外，還與心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[6]。雖然NAFLD 的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，但“兩擊”理論正越來越多地被接受，第一次打擊涉及肝臟甘油三酯過多和膽固醇積聚。這使肝臟對(duì)第二次打擊變得敏感，包括肝臟氧化應(yīng)激升高和炎癥，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[7]。因此抑制脂質(zhì)蓄積及炎癥可能對(duì)NAFLD 的進(jìn)一步發(fā)展具有重要作用。

mi-RNAs 調(diào)節(jié)發(fā)育和生理的各個(gè)方面，包括代謝性疾病、心血管疾病、免疫功能障礙、癌癥及肝纖維化等。miR-34a 位于染色體1p36 上，已在肝細(xì)胞癌、乳腺癌、胃癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、急性髓系白血病、骨髓瘤和肺癌中被發(fā)現(xiàn)[8]。研究報(bào)道m(xù)iR-34a 在飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪肝中增加，可通過靶向肝臟NAD 依賴的脫乙酰化酶Sirtuin 1（Sirt1）參與膽固醇代謝的失調(diào)，sirt1 是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡、代謝性疾病和癌癥的重要酶。此外，大鼠和人NAFLD 和NASH 的進(jìn)展與miR-34a/sirt1/p53 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，人肝組織中miR-34a 的表達(dá)隨非酒精性脂肪肝的嚴(yán)重程度而顯著增加[9]。為進(jìn)一步闡明miR-34a 在NAFLD 中的作用，將miR-34a 抑制劑轉(zhuǎn)染L02 細(xì)胞，獲得高轉(zhuǎn)染效率。然后將L02 細(xì)胞與OA 孵育，建立NAFLD 細(xì)胞模型。我們發(fā)現(xiàn)OA 組的脂質(zhì)積累量明顯高于空白組，而抑制miR-34a 后脂質(zhì)積累量明顯低于空白組。以上結(jié)果表明，NAFLD細(xì)胞模型建立成功，miR-34a 抑制可能在抑制脂質(zhì)沉積方面起到積極作用。除了在脂質(zhì)代謝中的作用外，miR-34a 在NAFLD的炎癥中也起著重要作用[10]。本研究結(jié)果表明，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 在NAFLD 細(xì)胞模型中高表達(dá)，抑炎細(xì)胞因子IL-10 在NAFLD 細(xì)胞模型低表達(dá)，提示L02 細(xì)胞處于炎性浸潤(rùn)狀態(tài)，這些促炎細(xì)胞因子可能在NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。miR-34a 抑制后TNF-α、IL-6 的表達(dá)均受到抑制，IL-10的表達(dá)促進(jìn)，提示抑制miR-34a 可以有效地調(diào)節(jié)非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的炎癥狀態(tài)。

綜上所述，抑制miR-34a 可以減輕非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型中的脂質(zhì)堆積和炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為非酒精性脂肪肝的治療提供了理論依據(jù)。然而，miR-34a 抑制NAFLD 的保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。