劉亞飛，沈彥軍，楊 陽，晁 嵐，楊 芳

山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科 不孕不育診療中心，濟(jì)南 250012

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種小型環(huán)狀DNA病毒，可感染人的皮膚和黏膜并引發(fā)一系列病變，如尖銳濕疣、口咽癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌等[1- 2]。根據(jù)其臨床致病風(fēng)險又將HPV分為高危型和低危型兩大類，其中HPV 16亞型(HPV- 16)為最常見的高危型HPV之一[3]。E7為宿主細(xì)胞被高危型HPV轉(zhuǎn)化至癌變過程中重要的致癌基因之一，盡管其主要生物學(xué)功能被認(rèn)為是通過降解pRb釋放E2F轉(zhuǎn)錄因子而使細(xì)胞周期紊亂引發(fā)腫瘤的形成[4- 5]，但在其他應(yīng)激條件下，如DNA損傷后，E7還可以誘導(dǎo)DNA重復(fù)復(fù)制進(jìn)而使細(xì)胞產(chǎn)生多倍體引發(fā)基因組不穩(wěn)定[6- 7]，然而其分子機(jī)制尚不明了。本研究試圖在穩(wěn)定表達(dá)HPV- 16 E7的細(xì)胞中探索早期有絲分裂抑制因子1(early mitotic inhibitor 1，Emi1)與DNA重復(fù)復(fù)制之間的相互關(guān)系，以期進(jìn)一步了解DNA損傷后HPV- 16 E7引發(fā)宿主基因組不穩(wěn)定性的分子機(jī)制。

材料和方法

細(xì)胞系構(gòu)建與培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系(human retinal pigment epithelium cell line，RPE)1培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的1∶1 DMEM-Ham’s F12培養(yǎng)基中。RPE1 E7及RPE1 Vector細(xì)胞構(gòu)建同文獻(xiàn)[6]，將穩(wěn)定表達(dá)HPV- 16 E7的RPE1 E7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，穩(wěn)定表達(dá)空載體的RPE1 Vector細(xì)胞作為對照細(xì)胞。

DNA損傷條件的建立及分組使用終濃度為2.5 μg/ml的博來霉素(APExBIO)作用于目的細(xì)胞30 min，之后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次并添加新的培養(yǎng)基。分組：實(shí)驗(yàn)組：RPE1 E7及RPE1 Vector細(xì)胞經(jīng)博來霉素處理；陰性對照(negative control，NC)組：RPE1 E7及RPE1 Vector細(xì)胞不經(jīng)博來霉素處理，而是用等量的磷酸鹽緩沖液代替。

流式細(xì)胞術(shù)收集細(xì)胞后重懸于70 %乙醇中固定過夜，之后用PBS洗滌2次并重懸，使用碘化丙啶(Sigma，PBS中50 μg/ml)進(jìn)行細(xì)胞染色30 min，并在其中添加70 μg/ml核糖核酸酶A(Sigma)，最后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)分析。有關(guān)細(xì)胞周期分析的相關(guān)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次及以上。使用FlowJo軟件(Tree Star，Ashland，OR)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[6]。

免疫印跡在放射免疫沉淀裂解緩沖液(Santa Cruz)中制備總細(xì)胞裂解物。通過雙辛可寧酸蛋白測定試劑(Invitrogen)測量蛋白濃度。在SDS聚丙烯酰胺凝膠中分離細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜與抗Emi1抗體(abcam，ab187144)共同孵育后，再與二抗共同孵育，然后在成像儀上進(jìn)行成像。辣根過氧化物酶共價相連的山羊抗兔抗體被用作二抗，GAPDH(Santa Cruz)用于指示總蛋白的上樣量。關(guān)于目的條帶的位置，盡管Emi1蛋白的相對分子質(zhì)量為50 000左右，而經(jīng)過顯色成像后實(shí)際觀察到的目的條帶則位于56 000，且與抗體說明書上顯示的條帶相一致，因此認(rèn)為56 000處的條帶即為Emi1的目的條帶。有關(guān)免疫印跡的相關(guān)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次。ImageJ(美國國立衛(wèi)生研究院)用于量化凝膠圖像[6]，相對灰度值=Emi1條帶灰度值/GAPDH內(nèi)參灰度值。

小干擾RNA實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步明確DNA損傷后Emi1在HPV- 16 E7引起的DNA重復(fù)復(fù)制中所發(fā)揮的作用，設(shè)計合成2條獨(dú)立的Emi1-小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)用來沉默Emi1的表達(dá)，以觀察相應(yīng)細(xì)胞多倍體產(chǎn)生的改變情況。在轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞接種到60 mm的培養(yǎng)皿中，使用脂質(zhì)體2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑，按照其說明書進(jìn)行操作，siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞終濃度為20 nmol/L。72 h后收集細(xì)胞并將其分為兩份，一份用來分析細(xì)胞周期，方法同“流式細(xì)胞術(shù)”中所述；另一份用來做免疫印跡分析，方法同“免疫印跡”中所述。實(shí)驗(yàn)中用到的2條獨(dú)立siRNA寡核苷酸序列如下：Emi1-siRNA- 01：5’-GATTGTGATCTCTTATTAA- 3’；Emi1-siRNA- 02：5’-AAGCACUAGAGACCAGUAGAC- 3’；陰性對照siRNA：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’。有關(guān)siRNA干擾的相關(guān)實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次。

結(jié) 果

DNA損傷后HPV- 16 E7引起的細(xì)胞周期比例變化在RPE1 E7細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)顯著的DNA重復(fù)復(fù)制，細(xì)胞多倍體比例達(dá)(15.57 ± 2.22)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.397，P=0.0031)；而在RPE1 Vector細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)胞多倍體比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.646，P=0.5534)(圖1A、1B)。在RPE1 E7細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)顯著的G2阻滯，G2期所占比例達(dá)(45.07 ± 6.93)%，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.864，P=0.0181)；而在RPE1 Vector細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組與對照組的G2期所占比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.422，P=0.6950)(圖1 A、1C)。

DNA損傷后HPV- 16 E7對Emi1蛋白表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)組RPE1 E7細(xì)胞中Emi1的蛋白表達(dá)水平顯著高于RPE1 Vector，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.241，P=0.0012)；而在陰性對照組，RPE1 E7及RPE1 Vector細(xì)胞中Emi1的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.448，P=0.2212)。RPE1 Vector細(xì)胞經(jīng)博來霉素處理后，Emi1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.549，P=0.0052)；而RPE1 E7細(xì)胞經(jīng)博來霉素處理后，Emi1的蛋白表達(dá)水平無變化(圖2)。

Emi1表達(dá)沉默對DNA損傷后HPV- 16 E7介導(dǎo)的DNA重復(fù)復(fù)制的影響在經(jīng)博來霉素處理的RPE1 E7細(xì)胞中應(yīng)用兩條獨(dú)立的小干擾RNA(Emi1-siRNA- 01和Emi1-siRNA- 02)沉默Emi1的蛋白表達(dá)后，可見DNA重復(fù)復(fù)制的比例顯著降低，si-Emi1- 01和si-Emi1- 02細(xì)胞多倍體所占比例分別為(3.94±0.66)%和(2.94±0.49)%，與轉(zhuǎn)染陰性小干擾RNA對照組(siCon)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.916，P=0.0434；t=3.452，P=0.0260)(圖3)。

RPE1：人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系；G1、G2：細(xì)胞周期的兩個階段；re-re：DNA重復(fù)復(fù)制，是DNA重復(fù)復(fù)制后產(chǎn)生的多倍體檢測區(qū)域；Apo：凋亡，坐標(biāo)最左側(cè)為細(xì)胞凋亡的檢測區(qū)域

Emi1：早期有絲分裂抑制因子1；Mr：相對分子質(zhì)量

討 論

宮頸癌是目前國內(nèi)外常見的婦女惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康[8- 9]，持續(xù)感染高危型HPV是引發(fā)女性宮頸癌的主要致病因素[10]。細(xì)胞癌變過程中的一個重要特征是基因組的不穩(wěn)定性[11- 12]，感染HPV后病毒基因隨宿主基因復(fù)制發(fā)生擴(kuò)增和重排，導(dǎo)致宿主細(xì)胞出現(xiàn)多種染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)變異，如染色體多倍體、缺失、倒位和染色體易位等[13- 14]，其中染色體多倍體是基因組不穩(wěn)定性的一個重要方面[15]。多倍體的產(chǎn)生是由于細(xì)胞周期調(diào)控紊亂導(dǎo)致在一次細(xì)胞周期中進(jìn)行了兩次及以上的DNA復(fù)制[16]。

2013年，有研究顯示細(xì)胞DNA損傷后HPV- 16 E7可引起DNA重復(fù)復(fù)制，當(dāng)時認(rèn)為HPV- 16 E7是通過影響Cdt1發(fā)揮作用[6]，之后又發(fā)現(xiàn)與Cdc6蛋白也相關(guān)[17]，但Cdt1與Cdc6均為進(jìn)入S期后直接參與觸發(fā)DNA復(fù)制起始許可的蛋白分子[18]，忽略了其上游Emi1及后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex/cyclosome，APC/CCDH1)的信號積累，即Cdt1與Cdc6可能只是這一過程的中間執(zhí)行者，而非“始作俑者”。

正常情況下，細(xì)胞在S期復(fù)制DNA之前必須先激活細(xì)胞周期依賴蛋白激酶，誘導(dǎo)E2F轉(zhuǎn)錄程序，并滅活A(yù)PC/C[19]。Emi1是早期有絲分裂抑制物，哺乳動物細(xì)胞周期的起始是由Emi1和CDK2的增高單向介導(dǎo)APC/CCDH1快速失活，使G1/S轉(zhuǎn)變得以單向進(jìn)行[20- 21]。并且在G1期，Emi1處于低水平，而APC/CCDH1處于高水平；而S期和G2期Emi1處于高水平，APC/CCDH1處于低水平[22- 23]。因此，如果Emi1表達(dá)持續(xù)增高，則APC/CCDH1活性就被抑制，使細(xì)胞在S期重復(fù)觸發(fā)DNA復(fù)制起始，引發(fā)DNA重復(fù)復(fù)制。

本研究顯示經(jīng)博來霉素處理誘導(dǎo)DNA損傷后，HPV- 16 E7可介導(dǎo)DNA重復(fù)復(fù)制，顯著促進(jìn)細(xì)胞多倍體比例的形成。另外，在DNA損傷后，Emi1的蛋白表達(dá)水平在HPV- 16 E7的作用下表現(xiàn)出了與對照細(xì)胞截然不同的狀態(tài)，即不僅不被降解且與DNA未損傷組表達(dá)幾乎無差異，提示Emi1在其中可能發(fā)揮著一定作用。為了進(jìn)一步探索Emi1在其中發(fā)揮的作用，利用小干擾RNA沉默Emi1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，HPV- 16 E7導(dǎo)致的細(xì)胞多倍體比例顯著降低，表明Emi1確實(shí)參與了DNA損傷后HPV- 16 E7導(dǎo)致的DNA重復(fù)復(fù)制這一過程，且在其中發(fā)揮積極作用。

另一方面，DNA損傷后啟動DNA修復(fù)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)信號傳遞和細(xì)胞周期進(jìn)程間的精確調(diào)控，從而保證僅在DNA修復(fù)完成后才可再次進(jìn)入細(xì)胞周期。研究表明Emi1在G2期DNA損傷檢查點(diǎn)起著至關(guān)重要的作用，可維持G2檢查點(diǎn)的可逆性，從而通過留出充足的時間進(jìn)行DNA修復(fù)和隨后的檢查點(diǎn)恢復(fù)降低細(xì)胞對DNA損傷的敏感性[24]。HPV- 16 E7在DNA損傷后通過促進(jìn)Emi1的高表達(dá)使細(xì)胞出現(xiàn)G2阻滯，其目的可能是為了進(jìn)一步修復(fù)DNA。然而這種修復(fù)也可能是Emi1導(dǎo)致的后復(fù)制修復(fù)，即需要在S期的復(fù)制過程中才能進(jìn)行的修復(fù)[25]。因此，DNA損傷后HPV- 16 E7導(dǎo)致的DNA重復(fù)復(fù)制也可能是Emi1介導(dǎo)的新一輪DNA修復(fù)過程，當(dāng)然這部分仍然需要進(jìn)一步的深入研究。另外，DNA損傷后，RPE1 E7及RPE1 Vector細(xì)胞均未發(fā)生顯著凋亡且兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明DNA修復(fù)起到了一定的作用。

siRNA：小干擾RNA；NC：未轉(zhuǎn)染siRNA的陰性對照組；siCon：轉(zhuǎn)染陰性siRNA的對照組；si-Emi1- 01：轉(zhuǎn)染Emi1-siRNA- 01的實(shí)驗(yàn)組；si-Emi1- 02：轉(zhuǎn)染Emi1-siRNA- 02的實(shí)驗(yàn)組

綜上，本研究在再次驗(yàn)證DNA損傷后HPV- 16 E7能夠引發(fā)DNA重復(fù)復(fù)制的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了Emi1在其中發(fā)揮的作用，發(fā)現(xiàn)Emi1的高表達(dá)可顯著促進(jìn)這一進(jìn)程，這也為深入了解HPV引發(fā)宿主基因組不穩(wěn)定性的分子機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。