楊鳳

（重慶能院石工食品檢測中心有限公司 重慶 402260）

1 前言

肉制品營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，是人體重要的營養(yǎng)來源，為保障肉制品的銷售質(zhì)量，有關部門通過現(xiàn)代技術加強對肉制品中羊源性成分的定性和定量檢測，保障羊肉的規(guī)范化經(jīng)營。本文針對羊源性成分檢測特異性、羊源性成分檢測靈敏度、肉制品中羊源性成分的定性檢測以及定量檢測進行試驗，以保證肉制品的質(zhì)量達到市場銷售標準，降低食品安全問題出現(xiàn)的概率。

2 試驗方法

2.1 材料與樣品

針對肉制品中羊源性成分的定性和定量檢測，本次選擇的肉制品主要有水牛肉、羊肉、驢肉、馬肉、兔肉、豬肉，并配備羊肉DNA模板。

2.2 方法

專業(yè)檢測人員可以提取這些肉制品中的DNA開展TaqMan RT-PCR擴增試驗，羊肉鮮肉樣品產(chǎn)生特異性擴增問題，而其余動物鮮肉的樣品未產(chǎn)生擴增問題。羊肉鮮肉樣品特異性擴增試驗用到的工具有探針、動物源性成分檢測引物，這2種工具可以被用來進行羊肉真?zhèn)畏矫娴臋z測以及鑒定，PCR反應循環(huán)閾簡稱Ct。不同動物的鮮肉組織特異性，可以通過Ct值檢驗方法表示。

對肉制品中羊源性成分進行定性和定量檢測，通過羊源性成分檢測靈敏度試驗，了解樣品產(chǎn)生特異性擴增的情況[1]。

羊源DNA/μL是羊肉DNA模板質(zhì)量濃度的單位，10 pg為1羊源DNA/μL，RT-PCR屬于擴增曲線，Ct值為33.44±0.08。 羊肉DNA模板為 0.001 ng/μL時，不會產(chǎn)生典型擴增情況，此時Ct數(shù)值是0.00，從試驗整體情況可以看出，如果引物與探針靈敏度是0.01 ng/μL，技術人員在擴增反應中就能夠了解10 pg羊源的DNA發(fā)展情況。

2.3 檢驗步驟

本試驗依據(jù)GB/T 25165—2010《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法 實時熒光PCR法》[2]，委托專業(yè)公司進行試驗工具的合成，并標出引物以及探針的序列。在試驗時提取肉質(zhì)樣品的DNA，可以利用液態(tài)氮進行研磨，之后利用十六烷基三甲基溴化銨進行DNA提取，運用nodrop 2000c核酸蛋白分析儀檢測其質(zhì)量濃度，將母液稀釋至100 ng/μL，并將其在－20℃溫度下保存。除了DNA提取外，檢測還應注意反應條件以及反應的具體體系，反應條件根據(jù)試驗人員分析確定，溫度為94℃，反應時間可以設置為1 min。試驗人員可以在94℃情況下，將反應時間設置為 5 s，60℃、31 s，45個循環(huán)。 試驗人員可以分別提取水牛肉、羊肉、驢肉、馬肉、兔肉、黃牛肉、狗肉、鹿肉、雞肉、鴨肉、牦牛肉、豬肉，對12種動物的鮮肉組織DNA開展RT-PCR擴增試驗，以PCR反應的循環(huán)閾值檢驗方式為基礎，了解這12種動物鮮肉組織的特異性。在稀釋羊肉DNA情況下，得到的質(zhì)量濃度分別為 100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL，并以濃度不同DNA模板開展試驗，了解RT-PCR反應，以Ct值檢驗方法為基礎依據(jù)，檢測不同質(zhì)量濃度的模板DNA，進而得出其檢測靈敏度，依據(jù)PCR反應的Ct值檢驗方法對加工肉制品進行定性以及定量檢測。以Ct值檢驗方法為主對不同的質(zhì)量濃度的羊肉干模板實施DNA檢測，得到靈敏度結果。擴增結果可以通過RT-PCR擴增儀分析軟件得到，之后計算Ct值，得到擴增曲線。

3 結果分析

技術人員將8個梯度的羊肉來源DNA稀釋模板進行試驗，質(zhì)量濃度分別為 100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL，結果詳見表 1。

羊源性成分定量檢測可以在RT-PCR擴增試驗基礎上獲得，得到曲線方程Y=－3.939X+48.826（R2=0.990 8），其中，Y為Ct值，X為DNA質(zhì)量濃度的對數(shù)。通過方程可以計算出羊肉中羊源性成分Ct值，通過技術人員的計算了解羊源DNA模板質(zhì)量濃度，從羊源性成分檢測方法中，利用含有羊源性成分檢測的引物和探針，定性檢測與定量檢測可以同時進行[3]。

表1 羊肉DNA梯度稀釋模板的RT-PCR擴增試驗結果

4 討論

技術人員在定量加工肉制品羊源性檢測期間，需要用到2種工具，分別是探針、羊源性成分檢測的引物，羊肉來源DNA梯度稀釋溶液可以作為本試驗模板，并進行擴增試驗，模板的DNA濃度為0.01ng/μL，RT-PCR與原來一致，是擴增曲線，這種情況下，Ct值是 33.44±0.08。

RT-PCR反應能夠?qū)⒀蛟葱猿煞诌M行定量檢測，0.01 ng加工肉制品的來源為DNA。羊肉來源DNA梯度稀釋模板的RT-PCR擴增試驗，Ct值0.001。以上結果說明，若羊特異性引物和探針的檢測靈敏度為0.01 ng/μL，RT-PCR試驗就可以將10 pg羊源DNA檢測出來[4，5]。

5 結語

近年來，市場上的肉制品出現(xiàn)各種造假問題，因此，有關部門應對肉制品加強檢測，可以對肉制品中的羊源性成分進行定性檢測和定量檢測，通過不同試驗，可以了解不同肉質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量，保障市場上的肉制品質(zhì)量達到市場規(guī)定標準，減少由于肉制品造假出現(xiàn)的食品安全問題。