莫靜燕 黃皆竣 宋人杰

（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇紫龍藥業(yè)有限公司（質(zhì)檢中心） 江蘇常州 213000）

1 前言

鹽酸納布啡注射劑屬于臨床新型嗎啡類k類受體，具有止痛、鎮(zhèn)靜的作用，可于脊髓內(nèi)達(dá)到最高濃度，并且該藥物對(duì)血管、呼吸系統(tǒng)作用較小，因此廣泛用于術(shù)后鎮(zhèn)痛、小手術(shù)等[1]。產(chǎn)科患者使用納布啡進(jìn)行術(shù)后鎮(zhèn)痛作用顯著，可減輕術(shù)后疼痛，預(yù)防并發(fā)癥[2]。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中尚無(wú)鹽酸納布啡注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

為了提升該制劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，本文按照2015年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，對(duì)鹽酸納布啡注射劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗(yàn)證，并建立該制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，旨在為藥品生產(chǎn)和檢驗(yàn)監(jiān)督提供可行有效的方法學(xué)參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

1384-A2 型生物安全柜（Thermo Scientific）；GCS干熱滅菌柜 （山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；ET-96內(nèi)毒素凝膠法測(cè)定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；ZH-2振蕩混勻器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

2.1.2試劑

鱟試劑（批號(hào)1903041）、鱟試劑A（批號(hào)1811212）（靈敏度0.125 EU/mL，規(guī)格 0.1 mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑B（靈敏度0.125 EU/mL，規(guī)格0.1 mL/支，批號(hào)19030512，福州新北生化工業(yè)有限公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（規(guī)格50 mL/瓶，批號(hào)1706090，湛江安度斯生物有限公司）。

2.1.3供試品

鹽酸納布啡注射液（10mg∶1mL，批號(hào)為 19060161、19060261、19060361，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇紫龍藥業(yè)有限公司）。

3 方法

3.1確定細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）

根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[1]，藥品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值L一般按以下公式確定：

其中：L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值，EU/mg；K為人每千克體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素計(jì)量，鹽酸納布啡注射液屬于普通注射劑，故 K=5 EU/（kg·h）；M為人用每千克體重每小時(shí)的最大供試品劑量[3]。

原研說(shuō)明書規(guī)定：對(duì)于70 kg患者的皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥，通常推薦的成人劑量為10 mg；必要時(shí)，該劑量可每3～6h重復(fù)一次。在非耐受性個(gè)體中，推薦的單次最大劑量為20 mg，最大總?cè)談┝繛?60 mg[4]。 目前，鹽酸納布啡注射液（1 mL∶10 mg）擬在國(guó)內(nèi)銷售，同時(shí)為提高內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，人均體重按照中國(guó)人平均體重60 kg計(jì)算。

細(xì)菌內(nèi)毒素限值：

3.2 干擾初篩試驗(yàn)[5]

3.2.1 最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）和最低有效濃度（MVC）的計(jì)算

MVD是樣品的最大允許稀釋倍數(shù)，在MVD下，可以判斷細(xì)菌內(nèi)毒素限值，該方法適用于注射液或經(jīng)腸道的以溶解或稀釋形式給藥的藥品溶液。

其中，C為供試品溶液濃度，mg/mL；L為供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值，EU/mg；λ為鱟試劑的靈敏度，EU/mL。

根據(jù)公式（2）可計(jì)算出鹽酸納布啡注射液進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)時(shí)，使用不同靈敏度的鱟試劑所對(duì)應(yīng)的MVD分別為λ=0.25 EU/mL時(shí)，MVD為100倍，MVC 為0.1mg/mL；λ=0.125EU/mL時(shí)，MVD為200倍，MVC為0.05mg/mL；λ=0.06 EU/mL時(shí)，MVD為 400倍，MVC為0.025mg/mL；λ=0.03EU/mL時(shí)，MVD為800倍，MVC為0.012 5 mg/mL。

3.2.2 初篩試驗(yàn)

供試品組NPC（溶液A）制備：取1批鹽酸納布啡注射液，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水）分別稀釋100倍、200倍、400倍和800倍，使其質(zhì)量濃度分別為 0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/mL。

供試品陽(yáng)性對(duì)照組PPC（溶液B）制備：用上述梯度的BET水稀釋液作為溶劑，與4λ濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品等比混合的方法制備含有2λ（0.5 EU/mL）濃度內(nèi)毒素的供試品。

其中，E1為內(nèi)毒素濃度為1 EU/mL的陽(yáng)性溶液。

細(xì)菌內(nèi)毒素陽(yáng)性對(duì)照組PC（溶液C）制備：取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支，逐級(jí)稀釋制備成含2λ濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

陰性對(duì)照組NC（溶液D）：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，鹽酸納布啡注射液干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 鹽酸納布啡注射液干擾初篩試驗(yàn)結(jié)果

由表1結(jié)果可見(jiàn)，鹽酸納布啡注射液（10mg∶1mL）濃度稀釋到0.1 mg/mL或以下時(shí)，鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)未見(jiàn)增強(qiáng)或抑制的干擾作用。

3.3干擾試驗(yàn)

用靈敏度為0.125 EU/mL，選擇湛江安度斯和福州新北2個(gè)不同廠家的鱟試劑按照2015版《中國(guó)藥典》1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)，取3批鹽酸納布啡注射液（10 mg∶1 mL）用BET水將樣品逐步稀釋至0.05 mg/mL，用BET水和鹽酸納布啡注射液稀釋液將對(duì)應(yīng)的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至2λ（0.25 EU/mL）、λ（0.125 EU/mL）、1/2λ（0.06 EU/mL）、1/4λ（0.03 EU/mL）濃度的 PC 系列（溶液 C）和供試品陽(yáng)性對(duì)照PPC系列（溶液B），每一稀釋濃度平行4管，同時(shí)用上述供試品稀釋液（溶液A）和BET水（溶液D）各做2管陰性對(duì)照管，按公式計(jì)算BET水和供試品稀釋液反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es、Et），結(jié)果詳見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，只有當(dāng)鹽酸納布啡溶液A和陰性對(duì)照溶液D的平行管都為陰性，且鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列溶液的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)方為有效，計(jì)算系列鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列溶液和干擾試劑系列溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es和 Et）。 當(dāng) 0.5λ≤Es≤2λ 及 0.5Es≤Et≤2Es時(shí)，供試品在該濃度下無(wú)干擾作用。若鹽酸納布啡溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對(duì)試驗(yàn)有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過(guò)MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)進(jìn)行干擾試驗(yàn)。表2結(jié)果顯示，將本品稀釋200倍（0.05 mg/mL稀釋溶液），用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生化工業(yè)有限公司的鱟試劑試驗(yàn)，對(duì)內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)無(wú)干擾作用，表明3批鹽酸納布啡注射液（10 mg∶1 mL）所含細(xì)菌內(nèi)毒素未超過(guò)限度規(guī)定，3批鹽酸納布啡注射液（10 mg∶1 mL）的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

表2 鹽酸納布啡注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

本研究通過(guò)比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和鹽酸納布啡溶液中反應(yīng)的差異程度，確定鹽酸納布啡注射液在某一濃度下是否對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有增強(qiáng)或抑制作用。

不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑由于生產(chǎn)工藝、質(zhì)量參數(shù)等方面存在一定差異，因此其抗干擾能力不同，故本試驗(yàn)采用了湛江安度斯和福州新北2個(gè)不同廠家共3批樣品與鱟試劑的相容性進(jìn)行篩查試驗(yàn)，確定其無(wú)干擾的濃度范圍。內(nèi)毒素干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸納布啡注射液為0.1 mg/mL或以下濃度稀釋液時(shí)對(duì)鱟試劑無(wú)干擾作用。隨后進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)，3批鹽酸納布啡注射液0.05 mg/mL稀釋液與2個(gè)不同廠家各3個(gè)批次的鱟試劑進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果對(duì)2個(gè)廠家的鱟試劑均無(wú)干擾作用，Es和 Et均在 0.5λ～2λ，表明鹽酸納布啡注射液0.05 mg/mL稀釋液對(duì)以上2個(gè)廠家鱟試劑無(wú)干擾作用。

研究表明，鹽酸納布啡注射液（10 mg∶1 mL）可按2015年版《中國(guó)藥典》第一法（凝膠法）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，確定限值為2.5 EU/mg。