張健希

（盤錦檢驗(yàn)檢測(cè)中心（盤錦市疾控中心） 遼寧盤錦 124010）

1 前言

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）是在阿維菌素B1的基礎(chǔ)上通過(guò)化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾形成的大環(huán)酯類化合物，是一種高效半合成生物性毒殺蟲劑。根據(jù)R基取代基的碳原子數(shù)不同可分為B1a和B1b兩種成分[1]。其中，前者成分高于90%，屬于神經(jīng)性毒劑，尤其對(duì)同翅目等昆蟲具有顯著的防治效果，這種藥物長(zhǎng)期使用不會(huì)產(chǎn)生抗藥性[2]。目前，甲維鹽已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)水果、蔬菜以及農(nóng)作物病蟲害防治等的主要產(chǎn)品，但如果過(guò)量使用會(huì)污染環(huán)境，同時(shí)也會(huì)給其他非靶標(biāo)生物帶來(lái)不利影響。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，甲維鹽對(duì)家蠶、蜜蜂半數(shù)致死量（LD50）數(shù)值較低，進(jìn)一步說(shuō)明該藥物對(duì)于上述生物具有一定的毒性。目前國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，大多數(shù)農(nóng)作物中甲維鹽的最大殘留量為0.02μg/kg，而在歐盟國(guó)家要求其最大殘留量為0.01 μg/kg。國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）有關(guān)規(guī)定要求，棉花籽中該農(nóng)藥的最大殘留量為0.02μg/kg[3]。

當(dāng)前研究學(xué)者主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）進(jìn)行阿維菌素類藥物殘留分析檢測(cè)，同時(shí)還會(huì)采用熒光檢測(cè)器、紫外檢測(cè)器等方式，但由于熒光檢測(cè)過(guò)程中衍生條件不穩(wěn)定，樣品分析結(jié)果不夠理想，檢測(cè)器靈敏度較低，無(wú)法達(dá)到國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)中部分類別的限值要求[4]。在土壤、蔬菜、水果、水質(zhì)等基質(zhì)中，可以采用LC-MS/MS進(jìn)行阿維菌素類藥物的檢測(cè)，但該研究并沒(méi)有在仙草植株等復(fù)雜樣品中進(jìn)行。

2 材料和方法

2.1 儀器材料

儀器設(shè)備：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜、ESI電噴霧離子源）；高速勻漿機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹儀；固相萃取裝置；渦旋混合器；超聲波清洗儀；電子天平；移液槍。

試劑：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽B1a標(biāo)準(zhǔn)品；乙腈、甲醇（色譜純）；磷酸、氯化鈉、乙酸乙酯、醋酸銨（分析純）。

2.2 質(zhì)譜、色譜條件

液相色譜條件：色譜柱型號(hào)為ACQUITY UPLC BEH C18（1.7μm，2.1mm×50 mm），柱溫設(shè)置為 40℃，進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A相為乙腈，B相為5 mmol/L醋酸銨水溶液，流速為0.3 mL/min。設(shè)置洗脫程序?yàn)椋?～1 min內(nèi)用 10%的流動(dòng)相 A 洗脫；1～2.5 min內(nèi)流動(dòng)相A的比例逐漸增加到95%；2.5～4 min流動(dòng)相A保持95%洗脫；4～4.5 min內(nèi)流動(dòng)相A濃度降低到10%之后，系統(tǒng)平衡。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源、正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，毛細(xì)管電壓參數(shù)為5500V；離子源溫度 TEM：600℃；氣簾氣（CUR）：20 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；甲維鹽 B1a 的質(zhì)譜參數(shù)為母離子質(zhì)荷比、子離子質(zhì)荷比分別為886.4、126，158；定性定量離子質(zhì)荷比為158；停頓時(shí)間：0.1 s；碰撞能量分別為 34、39 eV。

2.3 樣品前處理分析

準(zhǔn)確稱取10 g（精確到0.01 g）樣品，將其置于50mL離心管中，加入乙腈和乙酸乙酯（體積比為1∶15）提取液20 mL，于高速勻漿機(jī)中勻漿處理1 min后，向離心管中加1 g干燥后的氯化鈉，充分振蕩混勻后，以5 000 r/min的速度進(jìn)行樣品離心，收集上層乙酸乙酯，再向原離心管內(nèi)加入15 mL乙酸乙酯，再次萃取，合并2次萃取液，等待凈化。在凈化過(guò)程開(kāi)始前依次用10 mL 1%磷酸、甲醇、水、甲醇、乙酸乙酯進(jìn)行固相色譜柱的預(yù)活化。當(dāng)溶劑流到吸附填充料表面之后需要將樣品萃取液轉(zhuǎn)移到固相色譜柱中，再使用3 mL乙酸乙酯進(jìn)行淋洗，去除淋洗液之后，采用10 mL醋酸銨和甲醇混合液進(jìn)行洗脫，將所收集的洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)到近干，之后向其中加入1mL甲醇進(jìn)行溶解，依次加入4mL水、5mL乙酸乙酯經(jīng)過(guò)混合萃取之后，靜置10 min，進(jìn)行上清液的收集，可以加入5 mL乙酸乙酯于上層液中，再次萃取收集萃取液，經(jīng)氮吹后定容于2mL的甲醇中[5]。

2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

在容量瓶中加入0.1 g甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在使用過(guò)程中將其稀釋到不同梯度濃度：1、5、10、50、100、200 ng/mL進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。同時(shí)，采用仙草空白機(jī)制，配制濃度基質(zhì)溶液，進(jìn)樣量為5 mL，通過(guò)上機(jī)響應(yīng)之后可獲得甲維鹽的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 研究結(jié)果

3.1 條件優(yōu)化

甲維鹽溶于大部分有機(jī)溶劑，在熒光檢測(cè)過(guò)程中需要使用乙腈提取樣品，將樣品濃縮后經(jīng)過(guò)衍生無(wú)須凈化，該方法的衍生過(guò)程條件復(fù)雜，易受外界因素的干擾，導(dǎo)致最終結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性相對(duì)較差[6]。本文選擇乙腈、丙酮、乙酸乙酯3種溶劑進(jìn)行樣品提取，最終采用乙腈和乙酸乙酯能夠完全提取甲氨基阿維菌素，乙酸乙酯濃縮后易于開(kāi)展后續(xù)的凈化操作，且對(duì)環(huán)境污染程度較小，因此，最終選取乙酸乙酯作為樣品提取溶劑。

凈化過(guò)程中分別采用不同的固相萃取柱進(jìn)行凈化效果分析，其型號(hào)有NH2柱、C18柱和PCX小柱等。阿維菌素和甲氨基阿維菌素雖然從理論上看是同種藥物，但由于甲維鹽結(jié)構(gòu)上存在甲氨基，相比阿維菌素藥物其性質(zhì)存在較大差異，尤其在凈化和樣品提取中差異較大，所以所使用的凈化條件不同。本文使用標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)行萃取，在NH2柱以及C18柱中均有一定程度的甲維鹽保留，其回收率分別達(dá)86%和45%，使用固相色譜柱PCX進(jìn)行凈化后其回收率達(dá)95%以上，由于分子結(jié)構(gòu)中含有甲氨基，表現(xiàn)為弱堿性，采用強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，對(duì)甲維炎修復(fù)性較好，同時(shí)仙草植株提取液中本身存在色素，利用固相色譜柱可去除非極性色素產(chǎn)生的干擾影響，以降低色素本身對(duì)系統(tǒng)的污染性，進(jìn)而提升樣品分析的靈敏度，但經(jīng)過(guò)PCX柱凈化的洗脫液中有部分醋酸銨，因此無(wú)法直接質(zhì)譜分析，需要利用乙酸乙酯經(jīng)萃取濃縮后再定容上機(jī)。

3.2 儀器條件的優(yōu)化

本研究中C18色譜柱對(duì)甲維鹽具有較強(qiáng)的保留性，流動(dòng)相分別為乙腈-水、甲醇-水、乙腈-醋酸銨3種溶液，經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)使用醋酸銨作為流動(dòng)相能夠促進(jìn)物質(zhì)離子化，進(jìn)一步提高質(zhì)譜的響應(yīng)值，最終選擇乙腈-醋酸銨作為本次試驗(yàn)的流動(dòng)相。甲氨基阿維菌素在自然界中性質(zhì)不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)化學(xué)改造修飾之后會(huì)以甲維鹽的方式存在，其分子量為1008.24，在試驗(yàn)中針對(duì)該物質(zhì)掃描時(shí)未發(fā)現(xiàn)母離子峰，主要是由于在水介質(zhì)中甲維鹽會(huì)解離出甲氨基阿維菌素以及苯甲酸鹽。因此，在質(zhì)譜分析時(shí)需要以甲氨基阿維菌素作為研究對(duì)象，其母離子峰為886.38。對(duì)離子源溫度、毛細(xì)管電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化之后，設(shè)定能夠達(dá)到最高的母離子強(qiáng)度，選定母離子之后，進(jìn)行子離子掃描，獲得二級(jí)質(zhì)譜圖，根據(jù)該圖可確定經(jīng)過(guò)裂解之后的特征離子碎片為158.35和82.74，進(jìn)而可以推測(cè)這2個(gè)子離子峰分別為甲氨基阿維菌素和苯甲酸鹽，針對(duì)去簇電壓、碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)特征離子碎片靈敏度最佳的儀器參數(shù)詳見(jiàn)表1。

表1 特征離子碎片靈敏度最佳的儀器參數(shù)

3.3 基質(zhì)效應(yīng)及線性方程

在1～200 ng/mL的線性范圍內(nèi)加入甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品，最終定量離子色譜峰的面積與物質(zhì)濃度具有良好線性關(guān)系，分別利用甲醇以及仙草基質(zhì)進(jìn)行上機(jī)分析，最終標(biāo)準(zhǔn)方程分別為Y=77120.9X+364327、Y=50256.8X+218.418。上述方程的相關(guān)系數(shù)均高于0.999，除此之外，基質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線斜率比能夠反映質(zhì)譜基質(zhì)的效應(yīng)度，仙草基質(zhì)和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率為1.18，可進(jìn)一步得出，仙草樣品具有較強(qiáng)基質(zhì)抑制作用，使用純?nèi)軇├L制標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)使結(jié)果低于實(shí)際值，在樣品定量中可以利用基質(zhì)配標(biāo)法進(jìn)行上樣。

3.4 方法準(zhǔn)確度和精密度

通過(guò)質(zhì)譜以及色譜優(yōu)化之后，在仙草樣品中檢測(cè)甲氨基阿維菌素的檢出限為0.05 μg/kg，測(cè)定下限為0.1 μg/kg，其靈敏度可滿足相關(guān)的樣品檢測(cè)要求。對(duì)于空白樣品在 0.1、10、50 μg/kg 3 個(gè)水平下加標(biāo)，分別為低標(biāo)、中標(biāo)、高標(biāo)條件，進(jìn)行甲氨基阿維菌素加標(biāo)回收測(cè)定，具體結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 甲氨基阿維菌素加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果

根據(jù)該結(jié)果可以得知，加標(biāo)樣品回收率可達(dá)70%～100%，符合檢測(cè)的準(zhǔn)確性需求，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于0.3%～8.2%，符合相關(guān)的檢測(cè)方法精密度需求，甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品、仙草空白樣品加標(biāo)樣品和實(shí)際樣品中甲氨基阿維菌素的質(zhì)譜圖詳見(jiàn)圖1～圖3。

4 討論

采用液相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)仙草中常用殺蟲劑的材料報(bào)道較少，雖然目前針對(duì)阿維菌素等相關(guān)農(nóng)藥的檢測(cè)方法較多，包括液相色譜、氣相色譜等，但這些方法的樣品前處理過(guò)程比較煩瑣。吳宇寬等[7]利用液相色譜加熱電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蔬菜水果中阿維菌素以及甲維鹽進(jìn)行檢測(cè)，張武等[8]采用液相色譜法對(duì)稻米中阿維菌素以及甲維鹽殘留進(jìn)行檢測(cè)。

圖3 實(shí)際樣品中甲氨基阿維菌素的質(zhì)譜圖

阿維菌素類農(nóng)藥是一種非典型非極性物質(zhì)，難溶于水，易溶于極性有機(jī)溶液，因此在提取阿維菌素農(nóng)藥殘留的過(guò)程中，大多采用乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑。在研究中發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯對(duì)阿維菌素的提取效率較高，因此本文選取乙酸乙酯作為提取溶劑。此外通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯對(duì)仙草中甲維鹽具有良好的提取效率，由于仙草中含有大量的色素、蛋白質(zhì)等極性物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)使液相色譜圖中出現(xiàn)較多的雜質(zhì)峰，進(jìn)而干擾最終的檢測(cè)結(jié)果[9]。本文利用液相提取液將水相、有機(jī)相進(jìn)行分離，使大多數(shù)極性組分在水相中溶解，從而減少雜質(zhì)的干擾。研究證明，樣品經(jīng)過(guò)前處理后雜質(zhì)干擾較少。本研究構(gòu)建了仙草中甲維鹽殘留樣品前處理方法并利用LC-MS/MS上機(jī)檢測(cè)，分別考察了不同凈化條件、質(zhì)譜條件以及提取條件，進(jìn)行條件優(yōu)化后，最終獲得的條件具有良好的靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。該方法能夠在分析過(guò)程中縮短檢測(cè)時(shí)間，具有較高靈敏度，并且可實(shí)現(xiàn)定量定性分析，符合國(guó)內(nèi)外對(duì)仙草中甲維鹽殘留限量值的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[10]。

5 結(jié)論

甲維鹽是一種高效半合成生物殺蟲劑，過(guò)量使用會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成污染，同時(shí)也會(huì)給非靶標(biāo)生物帶來(lái)不利影響，因此需要合理控制其含量。本研究采用LC-MS/MS進(jìn)行仙草中甲維鹽殘留量的測(cè)定，通過(guò)對(duì)提取、凈化、儀器分析等條件進(jìn)行優(yōu)化后，研究證明，該方法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，可達(dá)到國(guó)家檢測(cè)限值的要求。