謝麗媛 劉蓮 荊晶 安娜

[摘要] 目的 研究射干麻黃湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠內(nèi)皮生長因子受體（EGFR）/磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及氣道平滑肌保護(hù)作用。 方法 75只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為對照組，模型組，射干麻黃湯低、中、高劑量組，每組15只。除對照組外其余大鼠均建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，射干麻黃湯低、中、高劑量組分別灌胃給予大鼠10、20、40 g/kg的射干麻黃湯，1次/d。8周后，測定大鼠肺泡灌洗液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6及IL-1β水平、肺指數(shù)、肺組織超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）水平、大鼠肺組織及氣道組織病理學(xué)變化、肺組織中PI3K、EGFR mRNA水平及PI3K、EGFR蛋白水平。 結(jié)果 與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平、肺指數(shù)、肺組織MDA水平及PI3K、EGFR mRNA水平及PI3K、EGFR蛋白水平均顯著降低，肺組織SOD活性顯著升高（P < 0.05），肺組織及氣道平滑肌組織病理學(xué)明顯改善。 結(jié)論 射干麻黃湯明顯降低慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡灌洗液炎癥因子水平，改善大鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷及氣道平滑肌病理學(xué)變化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)EGFR/PI3K信號(hào)通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 射干麻黃湯;慢性阻塞性肺疾病;EGFR/PI3K信號(hào)通路;氣道平滑肌保護(hù)

[中圖分類號(hào)] R56? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（c）-0012-06

Protective effect of Shegan Mahuang Decoction on lung tissue of rats with chronic obstructive pulmonary disease and regulation of EGFR/PI3K signaling pathway

XIE Liyuan1? ?LIU Lian2? ?JING Jing3? ?AN Na4

1.Department of Teaching， Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830000， China; 2.Department of Emergency， the First People′s Hospital of Urumqi， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830011， China; 3.Clinical Research Center， Xinjiang Uygur Autonomous Region Hospital of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830000， China; 4.School of Basic Medicine， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830011， China

[Abstract] Objective To study the effect of Shegan Mahuang Decoction on endothelial growth factor receptor （EGFR）/phosphatidylinositol-3 kinase （PI3K） signaling pathway and airway smooth muscle protection in rats with chronic obstructive pulmonary disease. Methods According to the random number table method， 75 SD rats were divided into five groups， namely， the control group， the model group， the low-dose， medium-dose and high-dose Shegan Mahuang Decoction groups， 15 rats in each group. Except for the control group， all the other rats established the rat model of chronic obstructive pulmonary disease. The rats in the low-dose， medium-dose and high-dose Shegan Mahuang Decoction groups were given 10， 20， 40 g/kg Shegan Mahuang Decoction by gavage respectively， once per day. Eight weeks later， the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-6 and IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid， lung index， the lung tissue superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） level， histopathological changes of lung tissue and airway tissue in rats， PI3K， EGFR mRNA levels and PI3K， EGFR protein levels of lung tissue were measured. Results Compared with the model group， the levels of TNF-α， IL-6 and IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid， lung index， the levels of MDA， PI3K， EGFR mRNA and PI3K， EGFR protein in lung tissue were significantly decreased， SOD activity in lung tissue was significantly increased （P < 0.05）， and histopathology of lung tissue and airway smooth muscle was significantly improved. Conclusion Shegan Mahuang Decoction can significantly reduce the level of inflammatory factors in bronchoalveolar lavage fluid and improve the oxidative stress injury of lung tissue and histopathological changes of airway smooth muscle in rats with chronic obstructive pulmonary disease. The mechanism may be related to the regulation of EGFR/PI3K signaling pathway.

[Key words] Shegan Mahuang Decoction; Chronic obstructive pulmonary disease; EGFR/PI3K signaling pathway; Airway smooth muscle protection

慢性阻塞性肺疾病是以不完全可逆的氣流受限為特點(diǎn)的呼吸系統(tǒng)疾病。主要表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、胸悶、氣短等癥狀。由于目前臨床上治療慢性阻塞性肺疾病的藥物有限，且伴有治療效果不佳、不良反應(yīng)多等特點(diǎn)，所以對于治療慢性阻塞性肺疾病藥物的研發(fā)仍是當(dāng)前亟需解決的問題之一[1-2]。射干麻黃湯是基于中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中藥成方制劑，用于治療哮喘等多種呼吸系統(tǒng)疾病，且在臨床應(yīng)用中已表現(xiàn)出顯著療效[3-4]。然而射干麻黃湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠的作用及機(jī)制，目前鮮見明確報(bào)道。本文通過研究射干麻黃湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠EGFR/PI3K信號(hào)通路的調(diào)節(jié)及氣道平滑肌的保護(hù)作用，以期為慢性阻塞性肺疾病的臨床治療提供新的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

75只清潔級(jí)成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6～8周齡，平均體重（180±20）g，購買于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-0002，合格證號(hào)：NO.650100400011222），動(dòng)物房溫度20～24℃，濕度40%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)劃嚴(yán)格經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查（批準(zhǔn)號(hào)：IACUC201806）。實(shí)驗(yàn)過程中遵循“3R”原則。

1.2 藥品及試劑

射干麻黃湯中藥配方顆粒購自江陰天江藥業(yè)有限公司（批號(hào)：20191105）;脂多糖（LPS）購自北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)：L8880）;RIPA蛋白裂解液（貨號(hào)：P0013B）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（貨號(hào)：P0018M），腫瘤壞死因子α（TNF-α）（貨號(hào)：PT516）、白細(xì)胞介素（IL）-6（貨號(hào)：PI328）及IL-1β（貨號(hào)：PI303）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（貨號(hào)：S0103），丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貨號(hào)：S0131），PI3K（貨號(hào)：AF7749）、內(nèi)皮生長因子受體（EGFR）（貨號(hào)：AF1330）及GAPDH（貨號(hào)：AF1186）抗體購自碧云天生物科技有限公司;RNA提取試劑盒（貨號(hào)：AM1924）、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：4374966）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;氯化鈉注射液（生理鹽水）（500 mL，批號(hào)：2019120211）購自中國大冢制藥有限公司。

1.3 主要儀器及設(shè)備

ECLIPSETS100-F型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司;MRZ14M010型高速冷凍離心機(jī)購自美國Beckman公司;SpectraMax190型多功能酶標(biāo)儀購自上海美谷分子儀器有限公司;ChemiDoc XRS型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;BX50/BX-FLA/DP70型光學(xué)/熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.4 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立

除15只大鼠作為對照組外，其余60只大鼠參照文獻(xiàn)[5]方法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，具體方法為：將大鼠置入玻璃熏煙染毒箱內(nèi)熏香煙煙霧，1次/d，10支/次，每熏煙5 d間歇2 d觀察，并于第14、42、70天向大鼠氣管注入0.2 mL的LPS溶液，然后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)1周，使LPS在肺內(nèi)均勻分布。對照組大鼠每只氣管注入200 μL生理鹽水，無特殊處理。以大鼠肺組織病理學(xué)改變及肺功能下降視為大鼠造模成功。將造模完成后的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、射干麻黃湯低、中、高劑量組，每組15只，射干麻黃湯低、中、高劑量組參照文獻(xiàn)[6]根據(jù)大鼠體重按照10、20、40 g/kg的劑量灌胃給予大鼠射干麻黃湯中藥配方顆粒（以生理鹽水配置成混懸液），對照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥8周[6]，各組大鼠最后1次給藥24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平的測定

每組取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，從氣管小口處分別用6 mL生理鹽水灌洗左右肺各2次，回抽收集肺泡灌洗液，4℃下以1500 r/min，離心半徑10 cm，離心15 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.6 大鼠肺指數(shù)測定

每組取6只大鼠，頸椎脫臼法處死后，將大鼠稱重記為W1，迅速分離大鼠肺組織，對大鼠肺組織稱重后記為W2，按照公式計(jì)算大鼠肺指數(shù)。大鼠肺指數(shù)=W2（g）/W1（g）×100%。

1.7 大鼠肺組織SOD活性及MDA水平的測定

每組取6只大鼠的肺組織，組織勻漿器勻漿，采用BCA法測定勻漿液中蛋白量，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測并計(jì)算大鼠肺組織SOD及MDA水平。

1.8 大鼠肺組織病理學(xué)檢查

每組取6只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取大鼠肺組織，在10%中性甲醛中固定24 h后轉(zhuǎn)移至75%的酒精中，脫水、透明處理，石蠟包埋后5 μm切片，水浴展開，撈片，瀝干，置于烘箱中烤2 h，常規(guī)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色），在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察;切片常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行masson染色，觀察大鼠氣道組織病理學(xué)變化。

1.9 實(shí)時(shí)定量PCR檢測大鼠肺組織中PI3K、EGFR mRNA水平

每組取6只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取大鼠肺組織，采用RNA提取試劑盒提取大鼠肺組織中總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR檢測各組大鼠肺組織中PI3K及EGFR mRNA表達(dá)。各檢測基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物見表1，以β-actin為內(nèi)參，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.10 免疫組化檢測大鼠肺組織中PI3K、EGFR蛋白表達(dá)

每組取6只大鼠，頸椎脫臼處死后分離肺組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行3 μm切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水室溫封閉20 min，枸櫞酸鹽緩沖液加熱抗原修復(fù)，5%胎牛血清（BSA）封閉，37℃下放置30 min，滴加稀釋的PI3K、EGFR一抗（1∶200），4℃過夜。次日使用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后，依操作順序加入二抗（1∶100稀釋），37℃孵育15 min，PBS液沖洗;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（試劑C），37℃孵育15 min，PBS液沖洗;室溫DAB顯色，封片后應(yīng)用顯微鏡觀察，每一標(biāo)本隨機(jī)選取5個(gè)視野，在細(xì)胞漿內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃、棕色顆粒為陽性細(xì)胞，并計(jì)算免疫組化積分。將陽性細(xì)胞按染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;再按陽性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行評分，0分為陰性，1分為0%<陽性細(xì)胞比例≤10%，2分為10%<陽性細(xì)胞比例≤50%，3分為50%<陽性細(xì)胞比例≤75%，4分為75%<陽性細(xì)胞比例≤100%;兩者的乘積為免疫組化表達(dá)積分。

1.11 Western blot檢測大鼠肺組織PI3K、EGFR蛋白水平

每組取6只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取大鼠肺組織放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用勻漿器勻漿，充分裂解，置于4℃離心機(jī)以12 000 r/min，離心半徑15 cm，離心10 min，取上清液，加入SDS loading buffer，混勻后放入100℃水浴5 min，采用BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)PI3K、EGFR及GAPDH抗體（1∶1000）4℃孵育過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行免疫印跡灰度值檢測及定量分析。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及GraphPad Prism 5進(jìn)行作圖，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著升高（P < 0.05）;與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低（P < 0.05）。見圖1。

與對照組比較，*P < 0.05;與模型組比較，#P < 0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子α;IL：白細(xì)胞介素

2.2 各組大鼠肺指數(shù)比較

與對照組比較，模型組大鼠肺指數(shù)顯著升高（P < 0.05）;與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺指數(shù)均顯著降低（P < 0.05）。見圖2。

2.3 各組大鼠肺組織SOD及MDA水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織SOD活性顯著降低，MDA水平顯著升高（P < 0.05）;與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺組織SOD活性顯著升高，MDA水平顯著降低（P < 0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)檢查

對照組大鼠肺組織未見明顯病理性改變，與對照組比較，模型組大鼠肺組織組織細(xì)胞排列不整齊，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤及壞死細(xì)胞脫落，支氣管管壁厚度及支氣管平滑肌層厚度均明顯增加;與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺組織膠原沉積減少，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，支氣管壁厚度及支氣管平滑肌厚度降低。見圖3（封四）。

2.5 各組大鼠肺組織EGFR、PI3K mRNA水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織EGFR、PI3K mRNA水平顯著升高（P < 0.05）;與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺組織EGFR、PI3K mRNA水平顯著降低（P < 0.05）。見圖4。

2.6 各組大鼠肺組織EGFR及PI3K蛋白水平比較

與對照組比較，模型組大鼠肺組織EGFR及PI3K蛋白水平及免疫組化表達(dá)評分均顯著升高（P <0.05）;與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺組織EGFR及PI3K蛋白水平及免疫組化表達(dá)評分均顯著降低（P < 0.05）。見圖5、圖6（封四）。

3 討論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為慢性阻塞性肺疾病可歸于“肺脹”“咳嗽”等范疇內(nèi)。中醫(yī)古典醫(yī)學(xué)著作《內(nèi)經(jīng)·靈樞》中記載，“肺脹者，虛滿而喘咳”，肺脹之因，內(nèi)有郁結(jié)，先傷肺氣，復(fù)感外邪，肺氣不得發(fā)泄，則成肺脹[7-8]。由于肺臟感邪，遷延不愈，失治誤治，痰瘀稽留，從而損傷人體正氣，致使風(fēng)寒等邪氣易于反復(fù)入襲[9]。

EGFR是表皮生長因子受體家族成員之一，主要分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞表面[10]。研究表明[11]，機(jī)體內(nèi)EGFR信號(hào)通路的異常表達(dá)與肺癌、乳腺癌等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。PI3K是參與細(xì)胞增殖、分化等生理過程的重要信號(hào)通路[12]，肺組織細(xì)胞PI3K的異常激活也會(huì)引發(fā)并加重肺組織病變[13]。陳英等[14]發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病大鼠發(fā)病機(jī)制與EGFR相關(guān)信號(hào)通路的異常激活有關(guān)，同時(shí)抑制EGFR等相關(guān)蛋白的表達(dá)能夠顯著改善大鼠的病理狀態(tài);李敏靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病大鼠的發(fā)病機(jī)制與PI3K信號(hào)通路的異常有關(guān)，抑制PI3K及相關(guān)蛋白的表達(dá)能夠顯著抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖;吳中華等[16]報(bào)道了魚腥草素鈉能夠減輕慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織損傷，其機(jī)制也與抑制PI3K信號(hào)通路及相關(guān)蛋白的異常激活密切相關(guān)。

射干麻黃湯是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，由射干、麻黃、生姜等多種中藥材組成的中藥成方制劑，記載于我國著名中醫(yī)古典名著《金匱要略》，主要用于寒痰郁肺結(jié)喉等癥狀[3-4]。射干麻黃湯由射干（9 g），麻黃（12 g），生姜（12 g），細(xì)辛、紫菀、款冬花（各9 g），五味子（12 g），大棗（7枚），半夏（12 g）組成，是臨床治療肺疾病的常用方，方中射干、麻黃解表發(fā)汗，為君藥;紫菀、款冬花溫肺平喘為臣藥;生姜、細(xì)辛可溫肺化飲，五味子斂肺止咳，共為佐藥;甘草止咳，調(diào)和諸藥，為使藥;全方同用，可使痰飲內(nèi)消，進(jìn)而緩解肺病患者癥狀?，F(xiàn)代研究表明[17-18]，射干麻黃湯對上呼吸道感染、哮喘等疾病有明顯的改善作用。射干麻黃湯在支氣管哮喘、小兒肺炎、難治性哮喘等臨床應(yīng)用中已取得顯著療效[19-24];齊紅俠[25]研究報(bào)道射干麻黃湯聯(lián)合常規(guī)西藥治療慢性阻塞性肺疾病能夠顯著提高效果，改善患者慢性阻塞性肺疾病評分，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

TNF-α、IL-6及IL-1β水平是重要的炎癥因子指標(biāo)，TNF-α、IL-6及IL-1β水平的升高提示機(jī)體組織器官的炎癥加重[23-24]，SOD活性降低及MDA水平升高反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷加重[26-29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與模型組比較，射干麻黃湯各劑量組大鼠肺泡灌洗液TNF-α、IL-6及IL-1β水平、肺指數(shù)、肺組織MDA水平及PI3K、EGFR mRNA水平及PI3K、EGF蛋白水平降低，肺組織SOD活性顯著升高，提示射干麻黃湯能夠降低慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織炎癥因子水平，緩解肺組織氧化應(yīng)激狀態(tài)及氣道平滑肌病理性改變。

綜上所述，射干麻黃湯明顯降低慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡灌洗液炎癥因子水平，改善大鼠肺組織氧化應(yīng)激損傷及氣道平滑肌病理學(xué)變化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)EGFR/PI3K信號(hào)通路有關(guān)。

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（收稿日期：2020-04-15）