吳 丹 梁少姍 徐 峰 梁丹丹 李溪玥 朱 瑩 湯 雯 楊 帆 曾彩虹,

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膽固醇結(jié)晶(cholesterol crystals，CCs)脫落隨血流進(jìn)入腎臟組織，可沉積于腎小動(dòng)脈中，直接阻塞血流和(或)引起炎癥致腎單位丟失[1-3]。由于CCs在常規(guī)組織學(xué)制備過(guò)程中被有機(jī)溶劑溶解，使其光鏡下常表現(xiàn)為狹長(zhǎng)、兩頭尖、腰部凸的梭形空隙這一獨(dú)特的形態(tài)學(xué)改變。有關(guān)腎臟血管中CCs對(duì)組織及炎癥的影響已多有報(bào)道。在腎小管中亦可見(jiàn)到與動(dòng)脈中相似形態(tài)的結(jié)晶物，考慮為腎小管CCs。有關(guān)腎臟疾病伴腎小管CCs則缺乏研究。IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是我國(guó)最常見(jiàn)原發(fā)性腎小球腎炎，多項(xiàng)臨床(高血壓、持續(xù)蛋白尿、活檢時(shí)的腎功能受損和高尿酸血癥)和病理指標(biāo)(牛津分類)與預(yù)后相關(guān)。本研究旨在探討腎小管CCs在腎臟疾病尤其是IgAN中的發(fā)生率，及伴CCs的IgAN的臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后。

研究對(duì)象與方法

研究對(duì)象(1)常規(guī)閱片觀察2019年3月至2019年12月于國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心住院行自體腎活檢患者的光鏡切片5 025例，腎小管內(nèi)見(jiàn)CCs者納入研究，最終納入34例患者。 (2)收集2006年1月至2010年12月于我中心進(jìn)行IgAN牛津分類驗(yàn)證研究的患者，以及2018年1月至2019年12月我中心住院治療經(jīng)腎活檢明確診斷為IgAN的患者共3 784例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)腎臟病理明確診斷為IgAN；(2)活檢時(shí)年齡≥18歲；并具有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)過(guò)敏性紫癜、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等繼發(fā)性IgAN；(2) IgAN合并其他腎臟病，如糖尿病腎病、肥胖相關(guān)性腎病等；(3)合并有嚴(yán)重心、腦、肝、肺等疾病患者或影響其生存的嚴(yán)重疾病。最終納入腎小管CCs陽(yáng)性的IgAN患者147例，根據(jù)1∶ 3的比例在余下人群中隨機(jī)選擇(由電腦生成隨機(jī)數(shù)根據(jù)病理號(hào)抽取)同期腎活檢明確為IgAN的患者446例作為對(duì)照組。

資料收集(1)基本特征：性別、年齡、身高、體重并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、高血壓病史；(2)腎臟損害的臨床表現(xiàn)及輔助檢查：血清肌酐(SCr)、血清白蛋白(Alb)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(CH)、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、尿酸(UA)，24h尿蛋白定量、尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、腎小管功能指標(biāo)等；(3)隨訪記錄：治療方法[是否應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)，是否使用免疫抑制劑]、總隨訪時(shí)間、末次SCr，是否進(jìn)展為終末期腎病(ESRD)及時(shí)間。

定義

病理 腎活檢穿刺術(shù)采用B超定位負(fù)針吸引，標(biāo)本常規(guī)送光鏡、免疫熒光及電鏡檢查。觀察項(xiàng)目包括：(1)腎小管急性病變：腎小管上皮細(xì)胞扁平、刷狀緣脫落；(2)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)：炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度；(3)嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)：間質(zhì)中見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞；(4)小動(dòng)脈透明變性；(5)腎間質(zhì)泡沫細(xì)胞(interstitial foam cell,IFC)；(6)袢壞死(N)；(7)牛津評(píng)分由2名腎臟病理醫(yī)師參照最新版IgAN牛津分型完成。

相關(guān)指標(biāo) CCs：光鏡下腎組織可見(jiàn)狹長(zhǎng)、兩頭尖、腰部突、邊緣清晰的梭形空隙(圖1)；腎功能受損：活檢時(shí)估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)<60 ml/(min·1.73m2)；本研究采用EPI公式估算eGFR；低蛋白血癥：Alb<30 g/L；高膽固醇血癥：CH>6 mmol/L；高尿酸血癥：男性UA>420 μmol/L，女性UA>360 μmol/L；尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)升高：>9.7 U/(g·Cr)；尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)升高：>0.7 mg/L；慢性腎臟病(CKD)定義以及分期參考KDIGO標(biāo)準(zhǔn)；ESRD：eGFR<15 ml/(min·1.73m2)或開(kāi)始腎臟替代治療3個(gè)月。

統(tǒng)計(jì)分析本研究采用《SPSS 24.0》統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或者秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以頻數(shù)、百分率表示，采用Pearson卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier計(jì)算腎臟累積生存率。采用COX回歸模型計(jì)算腎臟預(yù)后相關(guān)危險(xiǎn)因素的風(fēng)險(xiǎn)比值(hazard rations，HR)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

膽固醇結(jié)晶的病理形態(tài)特點(diǎn)腎小管內(nèi)結(jié)晶多孤立出現(xiàn)，有時(shí)一處管腔內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)CCs，少數(shù)亦見(jiàn)多處腎小管腔內(nèi)存在CCs。腎小管內(nèi)的結(jié)晶形態(tài)與血管中相似，表現(xiàn)為狹長(zhǎng)、兩頭尖、腰部突、邊緣清晰的梭形空隙，周圍腎小管上皮細(xì)胞扁平，結(jié)晶周圍炎癥反應(yīng)，偶見(jiàn)多核巨細(xì)胞，小管周圍炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。未見(jiàn)腎動(dòng)脈和腎小管同時(shí)存在CCs的病例。

圖1 腎組織中膽固醇結(jié)晶(↑)A:腎臟小動(dòng)脈內(nèi)膽固醇結(jié)晶(PAS,×400)；B、C：腎小管內(nèi)膽固醇結(jié)晶，周圍見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(B：PAS,×400；C：Masson三色,×400)；D：膽固醇結(jié)晶肉芽腫形成，腎間質(zhì)纖維化(HE,×400)

不同疾病膽固醇結(jié)晶的發(fā)生和流行病學(xué)特征2019年3月至2019年12月自體腎活檢患者共5 025例，CCs陽(yáng)性患者共34例(0.68%)，男性26例，活檢時(shí)中位年齡31.5歲。7例在活檢前診斷為高血壓病，平均BMI為23.1±3.0 kg/m2。CCs在IgAN及具有腎臟意義的單克隆免疫球蛋白病(MGRS)中發(fā)生率顯高于其他疾病(表1)。MGRS：AL型淀粉樣變性37例，增生性腎小球腎炎伴單克隆IgG沉積11例(其中CCs1例)，輕鏈沉積5例。

表1 不同腎臟疾病中膽固醇結(jié)晶陽(yáng)性率

伴或不伴腎小管膽固醇結(jié)晶的IgAN患者的臨床經(jīng)篩查3 784例IgAN患者，伴腎小管CCs組中78例(78/147)腎活檢前即出現(xiàn)高血壓，顯著高于對(duì)照組(138/446)，兩組IgAN患者基線資料比較見(jiàn)表2，伴腎小管CCs組男性比例更高(73.6%)，病程更短，SCr、CH、TG、UA、尿蛋白定量、尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、腎小管損傷標(biāo)志物等指標(biāo)均高于對(duì)照組，Alb低于對(duì)照組，提示伴CCs的IgAN患者臨床表現(xiàn)更加嚴(yán)重。

表2 IgA腎病患者中結(jié)晶陽(yáng)性組與對(duì)照組基線資料比較

伴腎小管膽固醇結(jié)晶的IgAN患者病理表現(xiàn) 伴腎小管CCs的IgAN和無(wú)CCs的IgAN患者組織學(xué)特點(diǎn)比較見(jiàn)表3。伴腎小管CCs組在腎組織更易出現(xiàn)腎小管急性病變、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及腎間質(zhì)泡沫細(xì)胞。而在IgAN牛津評(píng)分中，伴腎小管CCs組的系膜增生、節(jié)段硬化、新月體、腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化積分較對(duì)照組增高(表3)。

表3 伴或不伴腎小管膽固醇結(jié)晶IgA腎病患者組織學(xué)特點(diǎn)

伴腎小管膽固醇結(jié)晶的IgAN隨訪及預(yù)后伴腎小管CCs組中位隨訪時(shí)間 15.3月(7.1，100.5)，對(duì)照組中位隨訪時(shí)間18.4月(10.9，90.8)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。至本研究截止時(shí)間，共75例患者進(jìn)入ESRD(伴腎小管CCs組38例，對(duì)照組37例)，其中2例活檢時(shí)eGFR<15 ml/(min·1.73m2)，后續(xù)隨訪腎功能未恢復(fù)。根據(jù)隨訪資料繪制腎臟生存曲線(圖2)，Log Rank檢驗(yàn)P<0.001，兩組患者腎臟生存時(shí)間存在明顯差異。在IgAN中，尿蛋白水平、腎功能受損程度、血壓狀態(tài)、高尿酸血癥、T病變?cè)u(píng)分是患者進(jìn)展至ESRD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，應(yīng)用ACEI/ARB可改善患者預(yù)后。本研究對(duì)CCs及上述臨床特征及病理指標(biāo)進(jìn)行單因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析。并將有意義的變量納入多因素COX回歸模型后發(fā)現(xiàn)，CCs陽(yáng)性(HR=1.83，P=0.047)、高膽固醇血癥(HR=1.92,P=0.018)、腎活檢時(shí)腎功能受損(HR=5.20,P<0.001)是影響腎臟預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而ACEI/ARB的使用則降低患者進(jìn)入ESRD的風(fēng)險(xiǎn)(HR=0.29,P=0.001)(表4)。

表4 腎活檢臨床指標(biāo)與長(zhǎng)期預(yù)后的關(guān)系

圖2 伴腎小管CCs組與對(duì)照組患者的腎臟生存曲線比較CCs:膽固醇結(jié)晶

討 論

膽固醇具有廣泛的生理作用，在血液中絕大多數(shù)都是和脂肪酸結(jié)合的膽固醇酯，不到10%為游離膽固醇。膽固醇本身具有形成結(jié)晶的特性[4]。常見(jiàn)的CCs見(jiàn)于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，斑塊破裂后結(jié)晶隨血流可栓塞至腎臟。1986年Nast等[5]首次報(bào)道腎小管中CCs，該作者觀察785例腎病綜合征接受腎活檢的病例，83例(10.5%)存在腎小管CCs，其中5例(0.6%)伴腎小管CCs肉芽腫性病變，2例為IgAN，2例為膜性腎病，1例為膜增生腎小球腎炎。但此后相關(guān)研究極少。本研究中腎小管CCs的總體發(fā)生率為0.68%，MGRS中僅1例出現(xiàn)CCs，其陽(yáng)性率高與MGRS病例數(shù)少有關(guān)，而DN患者中是否可見(jiàn)腎小管CCs仍需進(jìn)一步研究。

腎小管CCs多數(shù)在腎小管內(nèi)孤立存在，不伴細(xì)胞反應(yīng)(圖1B)，僅少數(shù)存在肉芽腫樣病變(圖1D)。此外，未發(fā)現(xiàn)腎小管和動(dòng)脈CCs同時(shí)存在的病例。本中心曾報(bào)1例多發(fā)腎小動(dòng)脈CCs，亦未見(jiàn)腎小管CCs同時(shí)存在[6]，提示腎小管和腎小動(dòng)脈CCs在形成機(jī)制和影響因素上可能存在差異。

IgAN以青壯年發(fā)病為主，在亞裔人群中，男女比例接近1∶ 1。本中心樂(lè)偉波觀察12年間IgAN患者中男性比例為49.3%[7]，本研究伴腎小管CCs的IgAN患者男性比例高達(dá)74.1%，提示腎小管CCs更易在男性IgAN中出現(xiàn)。伴腎小管CCs的IgAN高達(dá)52.7%的患者在活檢時(shí)已出現(xiàn)高血壓，高于同期對(duì)照組的30.9%(P<0.001)及本中心以往的IgAN報(bào)道[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)伴和不伴腎小管CCs的IgAN患者相比，前者Alb更低，蛋白尿更多，SCr、血脂、血尿酸明顯升高，CKD 3～5期的患者更多。病理形態(tài)學(xué)改變方面，伴CCs的IgAN患者，則表現(xiàn)為更多的病例腎小球存在M1、S1病變；腎小管間質(zhì)急性病變更明顯，包括間質(zhì)炎癥，其中嗜酸細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯高于對(duì)照組，間質(zhì)泡沫細(xì)胞也更常見(jiàn)。提示伴腎小管CCs的IgAN臨床和病理表現(xiàn)更重。

多因素分析還發(fā)現(xiàn)CCs陽(yáng)性、高膽固醇血癥、腎活檢時(shí)腎功能受損是影響腎臟預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而ACEI/ARB的使用則降低患者進(jìn)入ESRD的風(fēng)險(xiǎn)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)基線尿蛋白≥1g/d、高血壓、腎功能不全、高尿酸血癥等與IgAN預(yù)后明顯相關(guān)[7]，臨床應(yīng)加以重視。

有關(guān)腎小管內(nèi)CCs形成機(jī)制，因腎小管上皮細(xì)胞接觸復(fù)雜的蛋白尿成分，考慮兩種來(lái)源，一是膽固醇在腎小管腔內(nèi)積聚形成結(jié)晶，二是在腎小管胞漿內(nèi)形成釋放進(jìn)管腔中。管腔內(nèi)逐漸擴(kuò)大的晶體可穿入腎小管上皮細(xì)胞和基底膜，引起間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)，部分?jǐn)z取晶體，轉(zhuǎn)化為多核巨細(xì)胞。腎小管上皮細(xì)胞可以吞噬<10 μm的晶體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與溶酶體結(jié)合并試圖通過(guò)蛋白水解酶消化晶體[8]。當(dāng)溶酶體不能消化晶體時(shí)，引起膜破裂后溶酶體損傷。形成的CCs也可激活補(bǔ)體系統(tǒng)釋放促炎細(xì)胞因子，并經(jīng)炎癥小體依賴的途徑介導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的活化和分泌。IL-1β進(jìn)一步活化巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其他炎性因子和趨化因子釋放。這些機(jī)制的研究多集中在動(dòng)脈斑塊中的CCs。也有研究人腎小管上皮細(xì)胞在高糖條件下培養(yǎng)24h即出現(xiàn)膽固醇蓄積現(xiàn)象[9]，重組補(bǔ)體c1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3(CTRP3)蛋白干預(yù)也能夠抑制高糖條件下腎小管上皮細(xì)胞膽固醇蓄積[10]。本研究發(fā)現(xiàn)伴腎小管CCs的患者間質(zhì)炎癥浸潤(rùn)明顯高于不伴CCs者，提示腎小管中的膽固醇促發(fā)炎癥機(jī)制可能和腎動(dòng)脈中CCs類似，但因?yàn)槟I動(dòng)脈的三層結(jié)構(gòu)，其內(nèi)結(jié)晶更常是脫落至小動(dòng)脈，堵塞管腔。而腎小管上皮細(xì)胞為單層細(xì)胞，結(jié)晶突破腎小管基底膜，造成間質(zhì)炎癥反應(yīng)，腎小管損傷也很明顯，結(jié)晶作為異物，可以伴嗜酸細(xì)胞浸潤(rùn)。雖然有研究觀察腎小管膽固醇負(fù)荷，但本研究未觀察伴腎小管CCs的IgAN患者腎小管膽固醇水平，由于取材有限，也未在電鏡觀察腎小管中是否存在CCs。但間質(zhì)泡沫細(xì)胞浸潤(rùn)增多提示巨噬細(xì)胞處理脂質(zhì)存在異常，具體的機(jī)制需要更進(jìn)一步的研究。

總之，腎臟疾病可伴發(fā)腎小管CCs，IgAN發(fā)生率高于其他疾病，伴腎小管CCs的IgAN臨床病理表現(xiàn)重，預(yù)后更差，臨床應(yīng)加以重視，以期改善預(yù)后。