陳文燁,楊 帆,劉永偉,董福雙,趙 和,柴建芳,呂孟雨,周 碩

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 遺傳生理研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心,河北 石家莊 050051)

非生物脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量的重要因素[1]。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,經(jīng)常遭受高溫、干旱、冷害、高鹽、重金屬、機(jī)械損傷等各種逆境脅迫,這些逆境脅迫會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至導(dǎo)致其死亡[2-3]。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中,植物逐漸形成了對(duì)逆境的適應(yīng)和抵抗機(jī)制[4],在分子、細(xì)胞、器官、生理生化等水平上作出及時(shí)調(diào)節(jié)[5]。在受到非生物脅迫后,植物通過(guò)系列信號(hào)分子調(diào)節(jié)相關(guān)抗逆基因和蛋白的表達(dá),來(lái)改變自身生理生化水平以適應(yīng)逆境。

轉(zhuǎn)錄因子可與真核生物啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件特異性結(jié)合,是調(diào)控基因表達(dá)水平的DNA結(jié)合蛋白,在植物對(duì)非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用[6-11]。NAC(NAM, ATAF1/2和CUC2)[5]是一類植物特有的,并廣泛存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族[12-13]。大多數(shù)NAC轉(zhuǎn)錄因子具有N端保守結(jié)構(gòu)域和C端可變結(jié)構(gòu)域[8],其N端保守的NAC結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA序列,與其它NAC蛋白形成二聚體，而羧基端結(jié)構(gòu)域是高度可變的,可激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄[7-8]。研究發(fā)現(xiàn), NAC轉(zhuǎn)錄因子可以發(fā)揮多種生物學(xué)功能,調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[14-15]、器官的形成[16]、衰老[6,17-18]和生物量[15,19]等,同時(shí)可以參與植物對(duì)生物[9]和非生物脅迫[6,13,15,20-22]的響應(yīng)。

迄今為止,利用生物信息學(xué)方法已成功預(yù)測(cè)了大量NAC轉(zhuǎn)錄因子基因[23],尤其是在模式植物擬南芥和水稻中的研究比較多,已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因有117個(gè)，在水稻(Oryzasativa)中有151 個(gè)，在二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中有101個(gè)，在三角葉楊(Populustrichocarpa)中有163個(gè)，在大豆(Glycinemax)和煙草(Nicotianatabacum)中各有152個(gè)[7,24-26]。水稻OsNAC10基因過(guò)量表達(dá),可增強(qiáng)對(duì)干旱、鹽脅迫的耐受性,在干旱脅迫下水稻產(chǎn)量可以增加25%～42%[27]。擬南芥的ATAF1基因功能喪失后,抗旱能力提高[28]；但也有研究發(fā)現(xiàn),擬南芥中ATAF1基因的過(guò)量表達(dá)可增強(qiáng)抗旱性[29]。迄今對(duì)小麥NAC基因的相關(guān)報(bào)道較少,已有研究表明小麥TaNAC29基因在抗衰老、對(duì)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用；ABA信號(hào)通路和抗氧化酶參與TaNAC29介導(dǎo)的脅迫耐受機(jī)制[30]。本試驗(yàn)從小麥cDNA 中克隆了1個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因TaNAC-B072,并對(duì)TaNAC-B072基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)檢測(cè)及不同非生物逆境脅迫下的表達(dá)特征分析,為深入研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所育成的國(guó)審小麥品種金禾9123和小麥品種中國(guó)春為研究材料。小麥種子由河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所植物轉(zhuǎn)基因中心保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的處理及取樣 選取籽粒大小均勻、飽滿的金禾9123種子,在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中培養(yǎng),發(fā)芽后選取生長(zhǎng)近似的植株置于光照培養(yǎng)箱(光周期為16 h/8 h;溫度為24～26 ℃) 中水培,14 d后進(jìn)行高鹽(NaCl)、滲透(PEG)和冷(4 ℃)脅迫處理。具體處理方法為:對(duì)照組(NC)的幼苗置于光照培養(yǎng)箱中水培,在培養(yǎng)0、1、3、6、12、24、48 h后取樣;高鹽(NaCl)脅迫組使用200 mmol/L NaCl處理幼苗；滲透(PEG)脅迫組使用16.1%的PEG處理幼苗；將冷(4 ℃)脅迫組的幼苗置于4 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后3種處理分別于處理后1、3、6、12、24、48 h取樣。處理的樣品(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為8株混合樣)分別取根和地上部分。

不同組織的樣品取中國(guó)春灌漿期植株的根、莖、葉、旗葉和種子,每個(gè)樣品為10個(gè)植株的混合樣。

1.2.2 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 用Trizol法提取植物的總RNA； cDNA第一鏈的合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒。

1.2.3 小麥TaNAC-B072基因的克隆和生物信息學(xué)分析 以擬南芥AtNAC072基因的mRNA (NM_001084983.1)為參考序列,在小麥中進(jìn)行比對(duì)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),在3B染色體上找到了1個(gè)可能的NAC基因,其在URGI的小麥Wheat reference sequence chromosome 3B CDS數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為TRAES3BF073600100CFD_t1。根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物(TaNAC-B072-F: ATGGCCACGTCATGCCCAG； TaNAC-B072-R: TCATGACCTCCTAAGGCTGGT),以中國(guó)春的cDNA為模板。PCR反應(yīng)使用TransStart FastPfu FlyDNA Polymerase(北京全式金生物技術(shù)有限公司),其50 μL反應(yīng)體系為: FastPfu Fly DNA Polymerase 1 μL、dNTP Mix 4 μL、5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL、PCR Stimulant 10 μL、上下游引物各1 μL、小麥cDNA 1 μL、ddH2O 22 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃ 2 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。將回收的目的片段與Blunt vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接,轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α,通過(guò)PCR對(duì)菌落篩選陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。用 ExPaSy 提供的在線Protparam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)和保守序列分析。利用Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)在線軟件對(duì)蛋白序列進(jìn)行比對(duì);利用MEGA 6.0軟件中的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(Bootstrap:1000; Mode /Method: Poisson model; Gaps/MissingData Treatment: Pairwise deletion)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 參照TaKaRa SYBR Green qPCR試劑盒實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物原則,設(shè)計(jì)目的基因qRT-PCR引物。上游引物TaNAC-B072-QF: 5′-ACGTCCACTCCGGCAACAAG-3′；下游引物TaNAC-B072-QR: 5′-CTAAGGCTGGTGGCGATGGG-3′。以小麥的18S rRNA為內(nèi)參,設(shè)計(jì)上游引物18S-QF: 5′-GATCCATTGGAGGGCAAGTC-3′；下游引物18S-QR: 5′-GATGCTTGCTTTGAGCACTC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR為20 μL體系: SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) 10 μL、ROX Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 5 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 3.8 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)在ABI 7500 Real-time System上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)? 95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,72 ℃34 s,45個(gè)循環(huán);在72 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。根據(jù)擴(kuò)增曲線確定每個(gè)基因和樣本相應(yīng)的Ct值,以18S為內(nèi)參基因,將0 h的表達(dá)量設(shè)為“1”,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算TaNAC-B072基因在不同脅迫處理下不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量,以及TaNAC-B072基因在成熟根、莖、葉、旗葉、種子中的相對(duì)表達(dá)量。使用Excel 2003處理數(shù)據(jù),利用SigmaPlot 12.0繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaNAC-B072 基因的克隆及鑒定

根據(jù)TaNAC-B072基因的序列,設(shè)計(jì)了引物,從小麥中國(guó)春的cDNA中擴(kuò)增到1條長(zhǎng)度為978 bp的序列(圖1)。TaNAC-B072基因的ORF長(zhǎng)度為978 bp,編碼蛋白長(zhǎng)度為325個(gè)氨基酸,推測(cè)其分子量為35.75 kDa,等電點(diǎn)為7.06。TaNAC-B072蛋白具有1個(gè)典型的NAC結(jié)構(gòu)域,位于第6～161個(gè)氨基酸區(qū)間。

D2000： D2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);TaNAC-B072： TaNAC-B072基因的擴(kuò)增結(jié)果。圖1 小麥TaNAC-B072基因的克隆結(jié)果

2.2 小麥TaNAC-B072基因的生物信息學(xué)分析

將預(yù)測(cè)的TaNAC-B072的氨基酸序列與來(lái)自二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon,BdNAC72-like:XM_014898637.1)、玉米(Zeamays,ZmNAC59:NCVQ01000009.1)、水稻(Oryzasativa,OsNAC2:XM_015766171.2)的蛋白進(jìn)行同源蛋白序列比對(duì),結(jié)果(圖2)顯示,TaNAC-B072與BdNAC72-like序列的相似性較高。

圖2 TaNAC-B072蛋白序列與其他NAC 蛋白序列的比對(duì)結(jié)果

將TaNAC-B072與上述蛋白序列,以及擬南芥(Arabidopsisthaliana,AtNAC: NM_001084983.1)、亞麻薺(Camelinasativa,CsNAC72:XM_010449838.1)、油菜(Brassicanapus,BnNAC72:XM_013816142.2)、白菜(Brassicarapa,BrNAC72-like:XM_009145150.2)、蘿卜(Raphanussativus,RsNAC72-like:XM_018591561.1)、辣椒(Capsicumannuum,CaNAC72-like:XM_016686297.1)、菠菜(Brassicaoleraceavar.oleracea,BoNAC72:XM_013743297.1)、醉蝶花(Tarenayahassleriana,ThNAC72:XM_010522599.1)、可可(Theobromacacao,TcNAC72:XM_007021266.2)、葡萄(Vitisvinifera,VvNAC72: XM_002284632.4)的蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,結(jié)果(圖3)表明,TaNAC-B072與BdNAC72-like的親緣關(guān)系較近。

圖3 小麥TaNAC-B072蛋白與其他NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 小麥TaNAC-B072基因的組織特異性表達(dá)

利用2-△△Ct方法計(jì)算小麥TaNAC-B072基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果(圖4)顯示,TaNAC-B072基因在小麥幼嫩的根、幼嫩地上部分和成熟的根、莖、葉、旗葉、種子中均有表達(dá),但表達(dá)水平不同,在幼嫩根中的表達(dá)水平顯著高于在其他組織中的。以TaNAC-B072基因在幼嫩根中的表達(dá)量為對(duì)照,在幼嫩地上部分和成熟根、莖、葉、旗葉、種子中的表達(dá)量分別是幼嫩根中的0.29、0.08、0.37、0.31、0.38和0.93倍。

圖4 TaNAC-B072基因的組織表達(dá)特異性

2.4 小麥TaNAC-B072基因在非生物逆境脅迫下的表達(dá)分析

分別以未經(jīng)過(guò)處理的小麥根和地上部分為對(duì)照,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)在高鹽(NaCl)、滲透(PEG)和冷(4℃)脅迫條件下小麥根和地上部分中TaNAC-B072基因表達(dá)水平的變化。結(jié)果(圖5)顯示：在鹽脅迫處理后,TaNAC-B072 基因在根中的表達(dá)量明顯下降,在6 h時(shí)下降到最低水平,在12 h時(shí)略上升后又下降;地上部分的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)上升,在24 h時(shí)上升到最高值,之后下降至初始水平。在滲透處理后,TaNAC-B072基因在根中的表達(dá)量明顯下降,在24 h時(shí)下降至最低水平,之后略有上升;在不同時(shí)間點(diǎn)在地上部分的表達(dá)量小幅波動(dòng),在1 h時(shí)略有上升,在3 h時(shí)下降,之后上升,在48 h時(shí)達(dá)到最高值。在冷處理后,TaNAC-B072基因在根中的表達(dá)量在24 h前明顯下降,在24 h后上升至初始水平;地上部分的表達(dá)量在3 h和12 h時(shí)略有上升,在其它時(shí)間點(diǎn)的變化不明顯。

圖5 基因TaNAC-B072在不同處理下的相對(duì)表達(dá)量

總之,TaNAC-B072基因的表達(dá)受到鹽、滲透和冷脅迫的影響,可能在小麥抵御脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起作用。

3 討論與結(jié)論

本研究利用電子克隆結(jié)合RT-PCR的方法,克隆了小麥基因TaNAC-B072；對(duì)該基因的序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TaNAC-B072蛋白結(jié)構(gòu)中包含1個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域,具有植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。TaNAC-B072的ORF長(zhǎng)度為978 bp,編碼蛋白長(zhǎng)度為325個(gè)氨基酸,推測(cè)其分子量為35.75 kDa,等電點(diǎn)為7.06,屬于中性蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示, TaNAC-B072蛋白屬于NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白,與BdNAC72-like蛋白的相似度較高。

利用qRT-PCR技術(shù)分析TaNAC-B072基因在小麥中的組織表達(dá)特異性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TaNAC-B072基因在小麥的根、莖、葉、種子中均有表達(dá),但表達(dá)量不同,其中在幼嫩根中的表達(dá)量最高,在種子中次之,在成熟根中的表達(dá)量最低。前人的研究報(bào)道顯示,油菜的BnNAC5基因主要在莖中表達(dá)[31]；番茄的SlNAC3基因在根部、花和果實(shí)中的表達(dá)量較高[32]。即不同的NAC基因在不同組織中的表達(dá)量存在差異,說(shuō)明不同的NAC基因家族成員可能在不同的組織中發(fā)揮作用。

已有的研究表明,多個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因與生物和非生物脅迫相關(guān)[13],參與了植物對(duì)脅迫的應(yīng)答和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。菊花的DgNAC1基因受鹽、干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo),DgNAC1基因過(guò)表達(dá)可提高煙草對(duì)鹽的耐受性[33];小麥的TaNAC2基因受高鹽、干旱和冷脅迫的誘導(dǎo),過(guò)表達(dá)TaNAC2基因可以提高植物對(duì)鹽、干旱和冷脅迫的耐受性[34];小麥根中TaNAC69-1和TaRNAC1的過(guò)表達(dá)可以增加根的長(zhǎng)度、生物量,并且TaRNAC1的過(guò)表達(dá)可提高植物的耐旱性,在水有限的條件下提高糧食的產(chǎn)量[14,35]。本研究的結(jié)果顯示,TaNAC-B072基因的表達(dá)受NaCl、PEG和冷脅迫的誘導(dǎo)或抑制，其中NaCl脅迫誘導(dǎo)小麥地上部分TaNAC-B072基因的表達(dá),但是抑制小麥根部TaNAC-B072基因的表達(dá);在滲透脅迫下,小麥地上部分TaNAC-B072基因的表達(dá)小幅波動(dòng),根部TaNAC-B072基因的表達(dá)受到抑制;在冷脅迫下,小麥TaNAC-B072基因在根中的表達(dá)量先明顯下降,之后上升至初始水平，而在地上部分的表達(dá)量在3 h和12 h時(shí)上升,在其它時(shí)間點(diǎn)變化不明顯。在小麥的不同組織部位,TaNAC-B072基因的表達(dá)對(duì)不同的非生物脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng),暗示該基因在不同組織中參與了不同的抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

小麥TaNAC-B072基因的表達(dá)受到高鹽、滲透和冷脅迫的誘導(dǎo)或抑制,說(shuō)明TaNAC-B072基因可能參與了小麥對(duì)非生物脅迫的響應(yīng),但TaNAC-B072基因在小麥中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制,還需要更多的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方面的研究來(lái)明確。本研究結(jié)果為探索小麥NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆中的作用提供了新的候選基因,也為深入探索小麥TaNAC-B072基因的抗逆機(jī)理提供了理論依據(jù)。