李浩 羅偉沼 石浩 楊曉瑩 王德信

[摘 要] 污染是多肉植物組織培養(yǎng)過程中的常見問題，嚴(yán)重影響了多肉植物的組培成功率。為了提高多肉植物組培苗的成活率，本文對多肉植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的污染及其產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，并提出防止污染使死亡率降至最低的有效方法，為多肉植物組織培養(yǎng)提供技術(shù)支持。

[關(guān)鍵詞] 多肉植物;組織培養(yǎng);污染;預(yù)防措施

[中圖分類號] S682.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1674-7909（2020）21-96-2

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及醫(yī)療保健業(yè)的進(jìn)步，人們越來越向往高質(zhì)量的生活，并出現(xiàn)了回歸自然的潮流，人們越來越熱衷養(yǎng)花來陶冶情操、緩解壓力。多肉植物是指某些營養(yǎng)器官具有發(fā)達(dá)的薄壁組織可以貯藏大量的水分，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上肥厚多汁的一類植物。多肉植物品種繁多、管理簡單、抗逆性強(qiáng)、顏色豐富、造型各異、易種植以及對土壤要求不高，并具有良好的空氣凈化功能。此外，多肉植物澆水少，屬于典型的懶人植物，近年來逐漸成為深受廣大消費(fèi)者喜愛的景觀植物。但是，多肉植物在長期栽培過程中存在質(zhì)量退化現(xiàn)象，珍貴的多肉植物成活率低、成本高;在自然條件下，短時間內(nèi)繁殖非常困難。通過組織培養(yǎng)技術(shù)可有效解決上述問題。利用多肉植物葉片、莖尖等作為外植體，通過誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽分化、生根和無菌苗移栽等多個步驟建立高效的快速繁殖體系，能有效加快多肉植物繁殖的工廠化進(jìn)程。但在多肉植物組織培養(yǎng)過程中，無菌苗經(jīng)常會出現(xiàn)污染現(xiàn)象，嚴(yán)重影響多肉植物組織培養(yǎng)效果。本文積極探討多肉植物組織培養(yǎng)中污染產(chǎn)生的因素，探尋預(yù)防策略，為多肉植物組織培養(yǎng)提供技術(shù)支持。

1 多肉植物組織培養(yǎng)中污染現(xiàn)象及其產(chǎn)生的原因

污染是在組織培養(yǎng)過程中，由于試驗(yàn)材料、環(huán)境等滅菌不徹底等原因，使細(xì)菌、微生物混入培養(yǎng)基中，從而產(chǎn)生細(xì)菌或者霉菌導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。因此，必須嚴(yán)格操作植物組織培養(yǎng)的每一步，將細(xì)菌、霉菌等微生物扼殺在搖籃里。

多肉植物組織培養(yǎng)污染現(xiàn)象主要由細(xì)菌和真菌造成的。細(xì)菌性污染是影響多肉植物組培的一種最主要因素，細(xì)菌種類主要是芽孢桿菌屬[1]，其次是假單胞菌屬，細(xì)菌體積小，傳播途徑多樣化，往往發(fā)生于接種早期，7 d內(nèi)即可顯現(xiàn)出來，并且極易擴(kuò)散，在培養(yǎng)材料周圍表現(xiàn)出水漬狀、斑塊狀，造成很多植物材料壞死。細(xì)菌來源主要為植物材料和接種用具等。真菌污染主要是霉菌（青霉菌為主）[2]，受真菌污染后多肉植物材料很快變黑，一般7 d左右能看到絨毛狀或者絮狀菌絲，菌落較大，多呈黑色。

污染的原因主要有以下幾個方面。一是培養(yǎng)基出現(xiàn)污染。培養(yǎng)基是植物離體培養(yǎng)組織賴以生存的營養(yǎng)基質(zhì)，是植物組織培養(yǎng)提供營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源。培養(yǎng)基成分中含有重要的營養(yǎng)物，主要包括大量元素及微量元素。在培養(yǎng)基滅菌過程中，其中任何一種營養(yǎng)物質(zhì)氧化或者滅菌不充分（壓力過大或過小、滅菌時間較短等）都會導(dǎo)致培養(yǎng)基遭到污染。二是儀器、用具出現(xiàn)污染。在接種過程中用到的試驗(yàn)儀器和試驗(yàn)用具，如鑷子、剪刀、濾紙等，如果攜帶大量細(xì)菌，而且沒有進(jìn)行高溫滅菌或滅菌不徹底，那么會導(dǎo)致微生物殘留、細(xì)菌增生。三是無菌操作技術(shù)不規(guī)范[3]。無菌操作不規(guī)范會將大量微生物帶入培養(yǎng)基，進(jìn)而導(dǎo)致外植體被污染，最終無菌苗出現(xiàn)大面積污染。四是沒有嚴(yán)格進(jìn)行消毒滅菌。在組織培養(yǎng)過程中沒有按照正確的操作步驟進(jìn)行消毒滅菌，漏掉其中的任一環(huán)節(jié)都會導(dǎo)致植物體殘留大量細(xì)菌。五是外植體滅菌不徹底。組織培養(yǎng)工作中最重要的一個環(huán)節(jié)是外植體滅菌，多肉植物莖葉中含有大量水分，如果滅菌不充分，培養(yǎng)過程中大量水分外泄，易滋生細(xì)菌，導(dǎo)致材料污染。

2 多肉植物組織培養(yǎng)污染現(xiàn)象的預(yù)防措施

在組織培養(yǎng)過程中嚴(yán)格控制無菌接種操作的每個環(huán)節(jié)，是控制組培污染的重要措施。無菌操作直接影響培養(yǎng)材料及培養(yǎng)基的污染率[4]，是組織培養(yǎng)控制污染的關(guān)鍵過程。針對以上污染產(chǎn)生的原因，在多肉植物組織培養(yǎng)過程中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

2.1 所用試劑與主要用具嚴(yán)格消毒滅菌

試驗(yàn)過程中用到的培養(yǎng)基需進(jìn)行嚴(yán)格的高壓蒸汽滅菌，較長時間不用可以放在4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。接種用的鑷子、剪刀、接種瓶、濾紙和培養(yǎng)皿等使用用具也需進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，一般121 ℃滅菌20 min效果較好。激素類試劑適合選用抽濾滅菌方式，一般用0.22 μm濾頭抽濾滅菌。

2.2 選擇合適試驗(yàn)材料

多肉組織培養(yǎng)工作的第一步是選擇合適的外植體，外植體種類直接影響組織培養(yǎng)的效果。多肉組織培養(yǎng)中葉片常常被選擇作為外植體，但是如果選擇雨天取材，往往細(xì)菌較多。晴天取材，由于陽光紫外線照射，具有一定殺菌效果，材料帶菌相對較少。因此，選擇外植體時，應(yīng)選擇生長旺盛部位，并在晴天取材[5]，以保證多肉植物組培效果佳。

2.3 選擇適宜的滅菌方式

由于多肉植物暴露在自然環(huán)境中，外植體會攜帶大量細(xì)菌。此外，多肉植物葉片多絨毛，不易滅菌，因此多肉植物外植體滅菌消毒一定要嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行。多肉植物外植體滅菌應(yīng)采用流水沖洗、洗衣粉浸泡、升汞及酒精消殺等方法，時間相對一般植物要長。具體操作為先將外植體用蒸餾水沖洗20～30 min，將洗衣粉放入盛有蒸餾水的燒杯中，攪拌并使其充分混勻，之后將多肉植物放到燒杯中，浸泡20 min;再輕輕搓洗葉片，用蒸餾水沖洗20～30 min，用0.1%升汞溶液浸泡10～15 min、75%酒精浸泡20 s，最后用無菌水沖洗3～5次，放入已滅菌的培養(yǎng)皿中的濾紙上吸水備用。這種滅菌方式效果佳。

2.4 嚴(yán)格實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)化無菌操作

無菌操作人員要自身做到盡量少帶菌，試驗(yàn)前穿隔離衣，用水和肥皂洗凈雙手，裸露手臂部位噴75%酒精，再進(jìn)入無菌操作室。無菌操作前，將雙手再用75%酒精噴霧消毒，將解剖刀、剪刀、鑷子等金屬試驗(yàn)工具用95%乙醇浸泡消毒，用乙醇燈外焰灼燒滅菌，后置于支架上冷卻備用;操作過程中動作要迅速快捷，盡量減少培養(yǎng)材料及器皿、工具等在空氣中的暴露時間;燃燒的酒精燈附近微生物無法存活，相對安全性高，操作以靠近酒精燈為宜。同時，在無菌操作過程中，一定避免外部無關(guān)人員進(jìn)出，可有效降低污染概率。

2.5 嚴(yán)格試驗(yàn)環(huán)境及試驗(yàn)場所滅菌

必須將無菌接種間、培養(yǎng)室等房間進(jìn)行高錳酸鉀、甲醛熏蒸或噴霧滅菌。超凈工作臺需要進(jìn)行紫外殺菌消毒20 min以上。如果用光照培養(yǎng)箱或者人工氣候室進(jìn)行培養(yǎng)，也需要用75%酒精進(jìn)行全面殺菌消毒。

培養(yǎng)室的溫度、濕度與污染率密切相關(guān)，高溫高濕適合細(xì)菌生長，造成雜菌生長，所以污染率高;空氣干燥不利于細(xì)菌繁殖，污染率低。因此，在多肉植物組織培養(yǎng)過程中應(yīng)適當(dāng)降低培養(yǎng)室濕度，以有效降低污染率。

3 結(jié)語

多肉植物組織培養(yǎng)是有效解決多肉植物快速繁殖的重要技術(shù)，不僅有利于多肉植物的大規(guī)模生產(chǎn)，而且可有效保護(hù)多肉植物物種的多樣性。但由于多肉植物組織含水量高，莖葉生長絨毛，在組織培養(yǎng)過程中操作不慎易造成嚴(yán)重污染，克服污染成為多肉植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)。完善多肉植物組培技術(shù)，建立針對不同科屬多肉植物的組培方案，優(yōu)化多肉植物組培快繁體系，降低污染率，提高多肉植物組培效率及成功率，才能更好地造福人類。

參考文獻(xiàn)

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[2]王洪波，郝會軍，丁雪珍，等.組培環(huán)境中污染菌種類初探[J].濰坊高等職業(yè)教育，2007（1）：43-45.

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基金項目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201710455124）;山東省重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2019GNC106113）;山東省高等學(xué)校青創(chuàng)科技支持計劃;菏澤學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心。

作者簡介：李浩（1997—），男，?？圃谧x，研究方向：植物組織培養(yǎng)。

通信作者：王德信（1975—），男，博士，副教授，研究方向：植物基因功能。