徐穎，傅芬

（1 江西省上饒市第二人民醫(yī)院，江西 上饒；2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西 南昌）

0 引言

卵巢癌是發(fā)生在卵巢的惡性腫瘤疾病，其病理類型復(fù)雜，其中85% -90%為卵巢上皮性腫瘤[1,2]，主要以卵巢漿液性癌最常見。由于卵巢解剖位置隱蔽，卵巢癌早期病變不易發(fā)現(xiàn)，而目前又缺乏卵巢癌普查和早期診斷的有效措施，導(dǎo)致多數(shù)患者就診時(shí)已達(dá)晚期[3]，治療效果和預(yù)后很差，致使卵巢癌的5 年存活率僅為40% -50%，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首[4]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，因其具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞周期和促進(jìn)發(fā)病機(jī)制的功能，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[5]。PAX8（paired-box 8) 是類非常保守的轉(zhuǎn)錄因子，特異性表達(dá)在甲狀腺、腎導(dǎo)管組織、副中腎管組織及其腫瘤中[6-8]。女性生殖系統(tǒng)起源于胚胎副中腎管，近年來有研究發(fā)現(xiàn)PAX8 是上皮性卵巢癌重要的標(biāo)志物[9,10]。本文利用GEO 和TCGA 公共數(shù)據(jù)庫重點(diǎn)研究PAX8 在卵巢癌中的表達(dá)情況，分析PAX8 與卵巢癌臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)源

本研究從GEO（https://www.geogroup.com）下載卵巢癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，通過cBioPortal(http://www.cbioportal.org/) 下載TCGA 卵巢癌臨床樣本的基因組數(shù)據(jù)，通過GTEx(https//www.gtexportal.org/) 數(shù)據(jù)庫下載正常卵巢樣本，從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載卵巢癌患者的臨床病理特征數(shù)據(jù)和表達(dá)值數(shù)據(jù)，從KM-plot 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）下載GEO 數(shù)據(jù)集合中患者的生存和預(yù)后信息。

1.2 方法

本研究在GEO 數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞：Ovarian cancer,限 制Organism 為Homo sapiens, 限 制Study type 為Expression profiling by array。 納 入 標(biāo) 準(zhǔn)：（1）數(shù) 據(jù) 集為全基因組的表達(dá)mRNA 芯片數(shù)據(jù)；（2）芯片平臺(tái)包括[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array,[HT_HG-U133A] Affymetrix HT Human Genome U133A Array, [HG-U133A_2] Affymetrix Human Genome U133A 2.0 Array,[HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array；（3）臨床樣本為卵巢癌組織和非卵巢癌組織（包括正常組織、非癌組織和癌旁組織）；（4）原始數(shù)據(jù)集為GEO。經(jīng)過條件檢索篩選出7 個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（GSE6008,GSE26712,GSE27651,GSE2945 0,GSE36668，GSE18520 和GSE52037），統(tǒng)一用RMA 算法對7 個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理，借助R 語言，利用Rstudio軟件（1.0.136 版本）和R 軟件（3.2.3 版本）對基因表達(dá)譜進(jìn)行Meta 分析。下載TCGA 卵巢癌臨床樣本的基因組數(shù)據(jù)（截止日期為2017 年10 月）, 選取的數(shù)據(jù)集為Ovarian Serous Cystadenocarcinoma。采用均數(shù)作為Kaplan-Meier 曲線分析以及Cox 回歸分析模型中的截?cái)嘀?。繪制Kaplan-Meier 生存曲線，采用對數(shù)秩檢驗(yàn)來檢驗(yàn)表達(dá)不同的兩組生存與基因表達(dá)有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用R 軟件（3.2.3 版本）對基因表達(dá)譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過SPSS22.0 的χ2檢驗(yàn)對基因表達(dá)水平與患者臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，生存分析采用Kaplan-Meier 法結(jié)合對數(shù)秩檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAX8 在卵巢癌中的表達(dá)水平

從7 個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集中收集到450 個(gè)樣本（396 個(gè)病例和54 個(gè)對照），篩查到PAX8 所對應(yīng)探針（221990-at）在所有7 個(gè)研究中與對照組比較均顯著上調(diào)（P＜0.01，表1）。

表1 PAX8 所對應(yīng)探針（221990-at）的差異表達(dá)情況

從7 個(gè)數(shù)據(jù)集得到的13,294 個(gè)基因的表達(dá)矩陣進(jìn)行Meta 分析，將GEO 數(shù)據(jù)集中Meta 分析的Z 值與P值進(jìn)行散點(diǎn)圖（圖1）比對，可以看出有明顯的線性關(guān)系，即兩種Meta 分析有明顯的一致性。PAX8 所對應(yīng)探針（221990-at）與對照組比較，顯著表達(dá)量顯著上調(diào)（Z=10.526,P=6.53E-26）。

圖1 7 個(gè)卵巢癌數(shù)據(jù)集中組織和癌旁組織表達(dá)差導(dǎo)的Meta 分析總結(jié)

圖2 PAX8 在癌癥組織和癌旁組織表達(dá)差異的Meta 分析的森林圖

通過計(jì)算效應(yīng)尺度加權(quán)均數(shù)差及其95%CI 繪制出Meta分析的森林圖（圖2）證實(shí)，PAX8 在多個(gè)研究中高表達(dá)穩(wěn)定，無異質(zhì)性（SMD ＝3.66，95%CI ＝2.88-4.45，P=0.02)。

為了驗(yàn)證以上結(jié)構(gòu)，本研究獲取截止2017 年10月TCGA 數(shù)據(jù)庫中卵巢癌臨床樣本的基因組數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包含了426 例卵巢癌臨床樣本，并通過GTEx 數(shù)據(jù)庫下載88 例正常卵巢樣本，進(jìn)行表達(dá)差異分析。與正常卵巢組織相比，PAX8 表達(dá)在卵巢癌組織中的確上調(diào)(P=1.55E-104)。

同時(shí)，通過對31 種腫瘤（包括9498 個(gè)病例和5540個(gè)對照）的分析顯示，PAX8 在大多數(shù)腫瘤的癌組織中均低表達(dá)，僅在CHOL、OV、PAAD、STAD、UCEC 和UCS中高表達(dá)，提示該基因在卵巢癌中發(fā)揮特異性調(diào)控作用。

2.2 PAX8 過表達(dá)對卵巢癌臨床表型的影響

從TCGA 網(wǎng)站下載415 例卵巢癌表達(dá)譜及臨床信息，分析探討了PAX8 表達(dá)水平與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性，PAX8 高表達(dá)與患者腫瘤TNM 分期、腫瘤組織學(xué)分級(jí)無關(guān)(P＞0.05)，而與患者的年齡有關(guān)(P＜0.01，表2)。

基于GEO 數(shù)據(jù)集中患者的生存和預(yù)后信息的生存分析（圖3），PAX8高表達(dá)確實(shí)與卵巢癌生存預(yù)后相關(guān)(P=0.0035，圖3-B)，高水平的PAX8 的患者生存能力好；且高水平的PAX8 的患者無病生存期也延長，提示PAX8 與好的生存預(yù)后顯著相關(guān)。以上兩個(gè)結(jié)果提示，PAX8 很可能作為腫瘤良好生存預(yù)后的預(yù)測因子，在卵巢癌的發(fā)生過程中可能具有重要作用，可能作為卵巢癌發(fā)生過程中潛在的預(yù)測靶點(diǎn)。

表2 PAX8 表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤組織學(xué)分級(jí)、腫瘤TNM分期的相關(guān)性

圖3 PAX8 表達(dá)在卵巢癌中的生存分析 A)基于總生存時(shí)間的分析；B)基于無病生存期的分析

3 討論

PAX（paired box）因子是類非常保守的轉(zhuǎn)錄因子，由配對域、八肽域和同源域三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，配對域是PAX 蛋白與DNA 結(jié)合的主要功能域，八肽域則行使轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)作用[11]。PAX 因子具有調(diào)節(jié)多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的功能，在機(jī)體的生長發(fā)育過程中對組織、器官的分化起著重要的調(diào)控作用。PAX 因子的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致多種器官發(fā)育畸形和惡性腫瘤的發(fā)生，例如脊柱畸形[12]、眼球缺損或白內(nèi)障[13]、腎細(xì)胞癌[14]、甲狀腺癌等。PAX8 是PAX 基因家族的一個(gè)成員，有研究報(bào)導(dǎo)PAX8 與泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)[15,16]，PAX8 突變體導(dǎo)致甲狀腺良、惡性腫瘤的形成[17]，但是目前PAX8 突變導(dǎo)致腫瘤形成的分子機(jī)制尚不明確。

本研究利用GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫分析卵巢癌中PAX8 表達(dá)情況。從GEO 數(shù)據(jù)庫篩選出7 個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)集進(jìn)行Meta 分析，結(jié)果顯示PAX8 在卵巢癌組織中的表達(dá)普遍高于癌旁組織。從TCGA 數(shù)據(jù)庫篩選出426 例卵巢癌臨床樣本進(jìn)行表達(dá)差異分析，同時(shí)通過對31 種腫瘤組織和正常組織的表達(dá)差異分析，均提示PAX8 在卵巢癌組織中高表達(dá)，PAX8 的過表達(dá)是卵巢癌的特異，和其他學(xué)者的研究結(jié)論一致。從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載415 例卵巢癌表達(dá)譜及臨床病理特征數(shù)據(jù)，同時(shí)下載GEO 數(shù)據(jù)集合中患者的生存和預(yù)后信息，結(jié)果顯示PAX8 高表達(dá)與腫瘤TNM 分期、腫瘤組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，而與患者的年齡有關(guān)，高表達(dá)的PAX8 的患者生存能力好，且高表達(dá)的PAX8 的患者無病生存期也延長，PAX8 高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示PAX8 很可能作為腫瘤良好生存預(yù)后的預(yù)測因子。

綜上所述，PAX8 表達(dá)于卵巢癌具有較高的特異性和敏感性，可作為卵巢癌的潛在預(yù)測靶點(diǎn)。卵巢癌中PAX8的表達(dá)與腫瘤TNM 分期、腫瘤組織學(xué)分級(jí)無關(guān)，而與患者年齡有關(guān)，PAX8 高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后較好。