田洪成 孟 夏 馬 鶴 王會君 李清春 王雁林

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科 山東 濱州 256603

熱應(yīng)激導(dǎo)致睪丸精子缺乏活力和精子減少是通過增加生殖細(xì)胞凋亡的方式實現(xiàn)的[1]。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，單次熱應(yīng)激處理后生殖細(xì)胞凋亡導(dǎo)致雄性小鼠生育力下降是一過性的，即小鼠睪丸生殖功能呈現(xiàn)一種可逆性變化[2-3]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，單次熱應(yīng)激后小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞未出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象[4]。小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌雄激素，雄激素是維持精子產(chǎn)生的重要激素[5]。因此，睪丸間質(zhì)細(xì)胞對單次熱應(yīng)激處理后小鼠睪丸生殖功能可逆性變化起到很重要的作用。目前，熱應(yīng)激后小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞抗凋亡機制鮮見報道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乙醛脫氫酶2(Acetaldehyde dehydrogenase,ALDH2)蛋白在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，其具有抗細(xì)胞凋亡的作用[6]。因此，本實驗擬明確ALDH2蛋白在小鼠熱應(yīng)激后是否具有表達(dá)差異，探討ALDH2在單次熱應(yīng)激致小鼠睪丸功能可逆性變化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡C57雄性小鼠(體質(zhì)量為25～30 g)18只，購自寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心(SPF級)，由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物中心(SPF級)提供飼養(yǎng)條件。

1.1.2 主要試劑 ALDH2多克隆抗體購自Abcam公司，山羊血清工作液、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑及含DAPI抗淬滅劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，蛋白提取試劑盒等購自凱基生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 睪丸熱損傷模型建立及標(biāo)本制備 18只雄性C57小鼠分別按給予熱應(yīng)激1、7、14 d隨機分為3個熱應(yīng)激組(n=3)和3個對照組(n=3)。腹腔注射戊巴比妥鈉(20 mg/kg)麻醉，止血鉗夾住小鼠頭部皮膚，待小鼠睪丸下降至陰囊，使對照組和熱應(yīng)激組小鼠下腹部分別浸入25℃、43℃恒溫水浴15 min。并于熱應(yīng)激后1、7、14 d 給予戊巴比妥鈉致死劑量處死小鼠，無菌低溫處理小鼠睪丸，右側(cè)睪丸置于4%多聚甲醛中固定，左側(cè)睪丸置于-80℃冰箱中保存[4]。

1.2.2 免疫組化染色 恒溫60℃烤箱烘4 h，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水；枸櫞酸鈉修復(fù)液抗原修復(fù)，冷卻至室溫，室溫3%H2O2避光孵育8 min；室溫山羊血清封閉30 min，滴加兔抗小鼠ALDH2多克隆抗體(1∶300)，室溫孵育1 h，置4℃孵育過夜；室溫孵育1 h，滴加聚合物輔助劑，37℃孵育15 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/小鼠IgG多聚體，37℃孵育25 min；顯色、復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹脂封片[4]。

1.2.3 蛋白印跡檢測 Western blot檢測ALDH2蛋白凱基蛋白提取試劑盒提取睪丸組織蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液-80℃凍存。凝膠電泳，100 V轉(zhuǎn)膜60 min，室溫5%的脫脂奶粉封閉60 min；加兔抗小鼠ALDH2多克隆抗體(1∶300稀釋)，搖床室溫孵育1.5 h；加入山羊抗兔IgG，搖床室溫孵育30 min；滴加稀釋后超敏發(fā)光液、避光曝光。利用軟件Image J分析蛋白光密度值。β-肌動蛋白作為內(nèi)參對照，數(shù)據(jù)以ALDH2/β-肌動蛋白比值表示，實驗重復(fù)3次[4]。

2 結(jié)果

2.1 ALDH2免疫組織化學(xué)檢測 免疫組化結(jié)果顯示，ALDH2蛋白陽性表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞(見圖1)。

2.2 ALDH2蛋白Western blot檢測 與對照組相比，熱應(yīng)激后第1 d，ALDH2蛋白表達(dá)無明顯改變；熱應(yīng)激組第7、14 d較對照組及熱應(yīng)激第1 d比較，ALDH2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；熱應(yīng)激第7 d與熱應(yīng)激第14 d，ALDH2蛋白表達(dá)無明顯改變(見圖2)。

3 討論

目前世界人口已超過70億，并且正以每年8000萬的速度增長。人口無節(jié)制的增長成為環(huán)境惡化、人類貧窮的主要原因。因此，避孕的研究越來越受到人們的重視，其也成為有效控制人口增長的最重要的手段。但是到目前為止，針對男性避孕的方法少之又少，主要有避孕套和輸精管結(jié)扎術(shù)等。而且，不可逆的絕育術(shù)占到了男性避孕方法的一半以上[7-8]。所以尋找安全、有效、可逆的男性避孕方法迫在眉睫。

WHO針對避孕方法提出的三大原則是：安全、有效、可逆。在臨床上，有一種疾病叫“隱睪癥”，即睪丸沒有正常的降到陰囊留在腹部。這種疾病可以導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞的缺失，但是如果在幼年時行手術(shù)，睪丸的生精功能是可以恢復(fù)的[7]。本課題組及其他學(xué)者前期研究發(fā)現(xiàn)：單次熱應(yīng)激后生殖細(xì)胞凋亡導(dǎo)致雄性小鼠生育力下降，然而這個過程是可逆性的，即其在一段時間內(nèi)是可以恢復(fù)其生育能力的[4]，根據(jù)這個現(xiàn)象，我們是否將其完善成為男性避孕的一種措施？目前其安全性及有效性尚未明確。因此，對于其機制的研究顯得越來越重要。

研究發(fā)現(xiàn)，生殖細(xì)胞凋亡是熱應(yīng)激后小鼠睪丸細(xì)胞出現(xiàn)的最明顯的變化，在單次熱應(yīng)激后的第7天，生精小管中僅基底膜處殘存有稀疏的散在分布的細(xì)胞，然而單次熱應(yīng)激后14天，生精小管中生殖細(xì)胞又開始規(guī)律排列[9]。我們發(fā)現(xiàn)，精原干細(xì)胞在生殖細(xì)胞再生中發(fā)揮了重要的作用，包括其干細(xì)胞增殖分化的因子[2]。同時，我們發(fā)現(xiàn)在單次熱應(yīng)激后睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡不明顯。睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要的功能是合成和分泌雄激素，雄激素可以促進(jìn)精子的產(chǎn)生及成熟[5]。因此，我們推測睪丸間質(zhì)細(xì)胞在單次熱應(yīng)激后小鼠睪丸生育能力可逆性變化發(fā)揮了重要作用，但其具體機制尚鮮見報道。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2蛋白在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，ALDH2基因位于第12號染色體的12q24.2位置，編碼由517個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，在抗心肌細(xì)胞凋亡方面具有顯著作用[10]。本實驗中，免疫組化顯示ALDH2蛋白的定位主要是在睪丸間質(zhì)細(xì)胞；蛋白印跡顯示ALDH2蛋白的表達(dá)量在單次熱應(yīng)激第1天與對照組相比是沒有明顯變化的，而熱應(yīng)激第7、14天表達(dá)量是明顯上升的。

研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2具有抗凋亡的作用，ALDH2酶在治療因酒精導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有很大的潛力，其是急性酒精中毒的保護(hù)因子，能阻止乙醇誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡、蛋白質(zhì)損傷和線粒體膜電位去極化[11]。在糖尿病大鼠研究中，ALDH2可以保護(hù)心肌細(xì)胞，抑制細(xì)胞的凋亡，ALDH2受體激動劑乙醇可顯著減少乳酸脫氫酶的釋放和caspase-3的活性，增加ALDH2的激活和Bcl-2/Bax mRNA的表達(dá)[12]。此外，研究發(fā)現(xiàn)ALDH2有抵抗氧化應(yīng)激的功能，ALDH2基因轉(zhuǎn)染可以抵抗H2O2誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞損傷和減緩凋亡，并伴隨著細(xì)胞內(nèi)活性氧的下調(diào)[13]。ALDH2轉(zhuǎn)基因可以明顯減緩乙醛誘導(dǎo)的心臟細(xì)胞的活性氧的生成，心肌細(xì)胞凋亡以及ERK1/2 和 SAPK/JNK的磷酸化[14]。

綜上所述，ALDH2具有顯著的抗凋亡作用，而熱應(yīng)激處理小鼠睪丸后，在睪丸間質(zhì)中ALDH2的高表達(dá)對減少生精細(xì)胞的凋亡可能存在著某種機制的聯(lián)系。然而，其具體機制仍需進(jìn)一步的研究與驗證。