張靜，王偉，毛相朝,3*

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院； 2.中國海洋大學(xué)海洋藥物教育部重點實驗室，醫(yī)藥學(xué)院：山東 青島 266003；3.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237)

殼寡糖又名甲殼胺，是甲殼質(zhì)部分或全部脫乙?；漠a(chǎn)物，主要來自海洋甲殼動物外殼、昆蟲及真菌細胞壁中的天然聚乙酰氨基葡萄糖[1]。由2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接成的殼聚糖，經(jīng)降解得到不同聚合度的殼寡糖(chito-oligosaccharides，COSs)[2]。據(jù)報道殼寡糖具有生物相容性、抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性[3-5]。Wang等[6]發(fā)現(xiàn)瓊膠寡糖可以清除羥基自由基、超氧陰離子，并推測瓊膠寡糖的抗氧化性可能與聚合度密切相關(guān)。但已知聚合度的海洋低聚糖的抗氧化性分子機制研究較少。

發(fā)生氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是由于體內(nèi)氧化/抗氧化系統(tǒng)作用失衡，傾向于氧化方向，進而產(chǎn)生有氧代謝的副產(chǎn)物活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，如超氧陰離子自由基、羥基自由基和過氧化氫等物質(zhì)[7-8]，體內(nèi)ROS過量致使細胞質(zhì)部分內(nèi)容物外流，進而破壞細胞膜的通透性和完整性[9]。皮膚作為人體最大的器官，是機體的天然保護屏障，長期慢性氧化會對其造成嚴重的氧化損傷[2]。目前，用于治療氧化損傷的藥物主要是酮類、酚類物質(zhì)[10-11]，但其生物相容性及細胞毒性等問題仍待解決。因此，開發(fā)高效低毒的抗氧化藥物及功能性食品至關(guān)重要。本研究選取低聚殼三糖(結(jié)構(gòu)見圖1)為研究對象，研究其對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細胞氧化應(yīng)激損傷的拮抗作用的主要途徑及其分子機制，以期為以殼三糖為海洋來源新型抗氧化應(yīng)激損傷的功能性食品或預(yù)防型藥物提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株與化合物

人永生化角質(zhì)形成細胞(HaCaT cell)(中國典型培養(yǎng)物保藏中心)在含有10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的MEM完全培養(yǎng)基中生長。聚合度為3的殼三糖(chitotriose hydrochloride，COS-3)購買自青島博智匯力生物科技有限公司，即以蝦蟹殼脫乙?；蟮臍ぞ厶菫樵?，利用凝膠過濾色譜法進行分離提純，再通過質(zhì)譜法等方法對結(jié)果進行分析[12]。

1.2 試劑與儀器

MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(依科賽生物科技有限公司)；青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)； 4%多聚甲醛(上海源葉生物科技有限公司)；BSA干粉(北京索萊寶科技有限公司)；H2O2溶液、噻唑藍溶液(MTT)和DCFH-DA粉末(美國Sigma-Aldrich公司)；總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western及IP細胞裂解液、RIPA細胞裂解液、上樣緩沖液(Loading Buffer 5×)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、BCIP-NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒、SDS-PAGE電泳液干粉及半干法轉(zhuǎn)膜液干粉(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；GAPDH和α-Tubulin單克隆抗體、羊抗兔p38和磷酸化p38(p-p38)單克隆抗體和Caspase 3單克隆抗體(美國CST公司)；羊抗兔IgG二抗(美國Santa Cruz公司)。其他試劑均為分析純。

STERI-CYCLE 371二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；AMR-100全自動酶標分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)；ESCO Class II B2生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司)；CP153C電子分析天平(美國OHAUS公司)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；GL-150B干式恒溫加熱器(海門Kylin-Bell儀器制造有限公司)；DMI 6000B熒光顯微鏡(德國Leica公司)；半干轉(zhuǎn)膜儀、垂直蛋白電泳儀(美國Bio Rad公司)。

1.3 MTT法檢測COS-3對HaCaT細胞的細胞毒性

取對數(shù)生長期生長到80%的HaCaT細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，在5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個平行孔(n=3)?；衔锝M分別加入20 μL終濃度為31.25、62.50、125.00和250.00 μg/mL的COS-3溶液，在培養(yǎng)箱中孵育24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸棄上清后向每個孔中加入150 μL DMSO溶液，37 ℃搖床振蕩10 min將甲瓚完全溶解，酶標儀在540 nm波長下測定吸光值(OD)[13]。細胞存活率以對照組的百分比表示。

1.4 H2O2氧化應(yīng)激損傷模型的建立

取對數(shù)生長期生長到80%的HaCaT細胞，以1×104個/孔接種于96孔板，在5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每組設(shè)置3個平行孔(n=3)。向各孔中加入20 μL不同終濃度(100、200、300、400和500 μmol/L)的H2O2溶液孵育12 h，孵育結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸棄上清后向每個孔中加入150 μL DMSO溶液，37 ℃搖床振蕩10 min，酶標儀在540 nm波長下測定OD值。細胞存活率以對照組的百分比表示。

1.5 COS-3抗H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞氧化損傷活性的篩選

取對數(shù)生長期生長到80%的HaCaT細胞接種于96孔板，每組設(shè)置3個平行孔(n=3)。將細胞隨機分為空白對照組(正常培養(yǎng)細胞)、損傷組(H2O2誘導(dǎo)的細胞)和化合物組(COS-3預(yù)處理的H2O2誘導(dǎo)損傷的細胞)。化合物組分別加入20 μL終濃度為31.25、62.50、125.00和250.00 μg/mL的COS-3溶液孵育12 h，再向損傷組和化合物組各孔中加入20 μL H2O2(300 μmol/L)溶液孵育12 h，孵育結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h，吸棄上清后向每個孔中加入150 μL DMSO溶液，37 ℃搖床振蕩10 min，酶標儀在540 nm波長下測定OD值。細胞存活率以對照組的百分比表示。

1.6 DCFH-DA法測定ROS的含量

取對數(shù)生長期生長到80%的HaCaT細胞，以3×105個/孔接種于6孔板，在5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。各實驗組的設(shè)置同1.5，每組設(shè)置3個平行孔(n=3)。孵育后吸棄培養(yǎng)基，加入1 mL稀釋好的20 μmol/L DCFH-DA溶液于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，熒光顯微鏡觀察熒光強度，激發(fā)和發(fā)射波長分別為488 nm和525 nm[14]。使用Image-J軟件對熒光圖進行定量分析，結(jié)果以對照組的百分比表示。

1.7 ELISA 法檢測細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脫氫酶(LDH)的含量

培養(yǎng)對數(shù)生長期的HaCaT細胞接種于96孔板，各實驗組的設(shè)置同1.5，每組設(shè)置3個平行孔(n=3)。收集上清液通過乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒用于LDH釋放量的檢測。用Western及IP裂解液裂解細胞，重懸并在冷PBS緩沖液中勻漿，離心后收集的上清液根據(jù)總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)用于SOD含量的檢測，SOD和LDH的檢測波長分別為450 nm和490 nm[15]。所有數(shù)據(jù)均以空白對照組的百分比表示。

1.8 Western blot法檢測p38MAPK信號通路和Caspase3凋亡蛋白的表達量

培養(yǎng)對數(shù)生長期的HaCaT細胞接種于6孔板，各實驗組的設(shè)置同1.5，孵育結(jié)束后吸棄培養(yǎng)基，向各孔中均勻加入100 μL的裂解液(80 μL RIPA+20 μL 5×Loading Buffer+1 μL PMSF)，冰上裂解10 min后，細胞刮刮下細胞，置于100 ℃干式恒溫加熱器中煮沸15 min收集蛋白樣品。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，使蛋白樣品上樣體積相同時對應(yīng)的內(nèi)參蛋白(GAPDH和α-Tubulin)濃度保持一致。通過SDS-PAGE分離蛋白后，半干轉(zhuǎn)50 min轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)，用5% BSA(2.5 g BSA干粉+50 mL TBS-T緩沖液)溶液4 ℃封阻16 h。隨后將NC膜用對應(yīng)特異性蛋白質(zhì)的不同一抗(Caspase-3、p-p38、p38、GAPDH和α-Tubulin，1∶1 000)在37 ℃搖床100 r/min孵育2 h，用含0.05%Tween-20的Tris(TBS-T)緩沖液洗滌細胞3次，再加入相關(guān)二抗(1∶5 000)在37 ℃搖床100 r/min孵育1.5 h。用TBS-T緩沖液洗3次，通過BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液顯色5～10 min[16]。對目的條帶拍照，再通過Image-J軟件對蛋白質(zhì)條帶進行定量分析，結(jié)果均以空白對照組的倍數(shù)表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均以(平均值±標準差)表示，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用One-Way ANOVA分析比較各組間數(shù)據(jù)差異的顯著度。其中，“△”表示H2O2損傷組與對照組之間的比較，“*”表示COS-3化合物組與H2O2損傷組之間的比較。0.01<△(*)P<0.05，表明具有統(tǒng)計學(xué)差異；0.001<△△(**)P<0.01，表明具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異；△△△(***)P<0.001，表明具有極其顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 COS-3對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用

通過薄層色譜分析得到COS-3(相對分子質(zhì)量：501.23)純度達到97%，質(zhì)譜圖如圖2A所示(ESI-MS質(zhì)譜圖結(jié)果由青島博智匯力生物科技有限公司提供)。采用MTT法測得不同濃度的COS-3(200、400、600、800和1 000 μg/mL)預(yù)處理的HaCaT細胞活力不低于94%(圖2B)，證明COS-3幾乎無細胞毒性，不影響后續(xù)實驗的結(jié)果。H2O2最佳造模濃度為300 μmol/L，細胞存活率為(44.6±5.9)%(圖2C)。4種濃度的COS-3對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞氧化損傷均有不同程度的抑制作用，125.00和250.00 μg/mL的COS-3預(yù)處理組可將受損細胞活力分別提高至(67.5±5.9)%和(73.2±3.4)%(P<0.01)，31.25 μg/mL和62.50 μg/mL的COS-3預(yù)處理組也可以提高細胞存活率，但沒有顯著性，結(jié)果見圖2D。

2.2 COS-3對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞內(nèi)ROS含量的影響

熒光顯微鏡觀察結(jié)果見圖3A，H2O2損傷組細胞內(nèi)熒光強度明顯增強，而COS-3預(yù)處理組熒光強度隨著濃度的升高呈濃度依賴性減弱。通過Image-J軟件分析可知，損傷組細胞內(nèi)ROS含量升高至對照組的(407.9±12.8)%。COS-3預(yù)處理組細胞內(nèi)ROS含量分別降至對照組的(300.3±15.0)%、(260.1±9.6)%、(169.3±8.0)%和(144.5±8.2)%(P<0.001)(圖3B)。結(jié)果說明H2O2誘導(dǎo)會使HaCaT細胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，直接表現(xiàn)為ROS含量的上升，而COS-3可以通過抑制受損細胞內(nèi)ROS含量的產(chǎn)生與積累，從根源上對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞氧化損傷起到拮抗作用。

2.3 COS-3對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞內(nèi)SOD含量及LDH釋放量的影響

損傷組細胞內(nèi)的SOD酶活力降低至對照組的(71.0±4.9)%，LDH釋放量升高至對照組的(810.5±90.4)%，但125.00 μg/mL和250.00 μg/mL COS-3預(yù)處理組細胞內(nèi)SOD的活性提高至對照組的(88.9±6.0)%、(91.6±8.9)%(P<0.05)，31.25 μg/mL和62.50 μg/mL COS-3預(yù)處理組也可以提高SOD的酶活力，但是沒有顯著性差異(圖4A)。62.50、125.00和250.00 μg/mL COS-3預(yù)處理組細胞內(nèi)LDH釋放量降低至對照組的(458.0±11.9)%、(374.7±45.4)%及(252.6±65.0)%(P< 0.01)，31.25 μg/mL COS-3預(yù)處理組也可降低LDH釋放量，但無顯著性差異(圖4B)。ELISA結(jié)果表明，COS-3能有效提高受損細胞內(nèi)SOD的酶活力并減少LDH釋放量，從而通過維持抗氧化系統(tǒng)的平衡和細胞膜的完整性，達到抗氧化損傷的保護效果。

2.4 COS-3對H2O2誘導(dǎo)HaCaT細胞內(nèi)p38MAPK和Caspase3表達水平的調(diào)控

損傷組細胞內(nèi)磷酸化的p38(p-p38)和Caspase3表達量均顯著升高，COS-3預(yù)處理組以濃度依賴效應(yīng)下調(diào)2種蛋白的表達量，結(jié)果見圖5A和圖5C。Image-J定量分析表明損傷組細胞內(nèi)p-p38和Caspase3分別為對照組的2.7和1.9倍，31.25、62.50、125.00 和250.00 μg/mL COS-3預(yù)處理組p-p38的表達量降至對照組的2.0、1.8、1.3和1.3倍(P< 0.001)(圖5B)，但COS-3對p38表達量沒有明顯影響；125.00 μg/mL和250.00 μg/mL COS-3預(yù)處理組Caspase3的表達量降至對照組的1.5和1.2倍(P< 0.01)，31.25 μg/mL和62.50 μg/mL COS-3預(yù)處理組也可降低Caspase3表達量，但無顯著性差異(圖5D)。Western Blot結(jié)果說明，COS-3可以通過降低p38MAPK信號通路的異常激活及凋亡蛋白Caspase-3的活化以抑制細胞凋亡。

3 討論

H2O2是體內(nèi)活性氧簇的主要組成成分之一，參與皮膚的慢性氧化過程，如皮膚衰老、色斑等疾病[17]。本研究結(jié)果表明，COS-3預(yù)處理組呈濃度依賴效應(yīng)地提高H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細胞的存活率。COS-3可以降低細胞內(nèi)ROS含量，增強SOD活性以及減少LDH釋放量，表明COS-3可以抑制受損細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的破壞程度，確保細胞膜的完整性以防止細胞內(nèi)容物的外泄。同時，COS-3也下調(diào)了MAPKs家族p38磷酸化的異常激活和促線粒體凋亡蛋白Caspase3的表達，由于p38MAPK信號通路的激活會誘發(fā)線粒體功能障礙促使Caspase3蛋白的表達從而促使細胞凋亡[16]，因此證實了COS-3可以通過抑制線粒體凋亡通路的激活來保護氧化應(yīng)激受損細胞。本研究表明，COS-3可以通過調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)的平衡以及線粒體凋亡通路的異常激活，從而對HaCaT細胞的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)出拮抗保護作用。

殼寡糖作為蝦蟹殼副產(chǎn)物來源的新型功能性已知聚合度的低聚糖，具有可生物降解、毒副作用小且獲取、攝入均十分方便和安全的特點[18-19]，因此可作為食品添加劑、保健品，也可用于預(yù)防及治療疾病等方面。本實驗明確了已知聚合度的殼三糖抗氧化應(yīng)激損傷的具體保護作用途徑及其分子調(diào)控機制。因此，COS-3值得進行進一步體內(nèi)研究，將COS-3的抗氧化應(yīng)激損傷及其分子機制在小鼠體內(nèi)實驗中進行驗證，且本研究進展將為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)防和治療開辟新途徑。