李鵬

摘要：擬南芥轉(zhuǎn)錄因子ILR3（IAA-Leucine Resistant 3）在鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、葡萄糖異硫氰酸鹽（glucosinolate，簡(jiǎn)稱GLS）的生物合成和病原體響應(yīng)方面起到重要作用。為更深入探索該轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)的更多功能，利用YAO基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9在擬南芥中表達(dá)，成功獲得ILR3基因編輯突變體。測(cè)序結(jié)果及序列分析結(jié)果表明，在ILR3編輯擬南芥中，該基因編碼區(qū)發(fā)生了堿基缺失或插入，導(dǎo)致蛋白ILR3保守結(jié)構(gòu)域丟失。并且，這些基因編輯突變體T2代幼苗與T-DNA插入突變體ilr3-2在缺鐵環(huán)境下表現(xiàn)出相同的性狀，進(jìn)一步驗(yàn)證ILR3轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)鐵的吸收及體內(nèi)平衡的作用，也為深入研究其更多生物學(xué)功能奠定了工作基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬南芥;AtILR3;YAO啟動(dòng)子; CRISPR/Cas9;基因編輯

中圖分類號(hào)： Q784? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）14-0078-05

CRISPR/Cas9（clustered regularly interspersed short palindromic repeats /CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)已被用于基因組編輯，具有很高的準(zhǔn)確性，并能高效完成真核基因組中基因敲除（knockout/knockin）和點(diǎn)突變[1]，在人類細(xì)胞[2-3]、植物[4]、動(dòng)物[5]、微生物[6]中均得到了很好的應(yīng)用，并取得了舉世矚目的成果。YAO參與擬南芥的胚胎發(fā)生及配子發(fā)育，主要表達(dá)于分裂能力強(qiáng)的組織中[7];中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所謝旗研究組通過(guò)YAO基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas[STBX]9[STBZ]，極大地提高CRISPR/Cas9編輯擬南芥基因組的效率[8]。

AtbHLH105/AtILR3（IAA-Leucine Resistant 3）基因?qū)儆跀M南芥bHLH家族Ⅳc亞家族[9]，所編碼的蛋白可與其他諸多蛋白協(xié)同作用，共同參與植物鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[10-11]。

筆者所在課題組在長(zhǎng)期的研究中發(fā)現(xiàn)，ILR3在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮更多的生物學(xué)功能。因此，本研究首次利用YAO基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cas9編輯擬南芥ILR3基因，所獲得的基因編輯株系發(fā)生堿基插入和缺失，與T-DNA插入突變體ilr3-2在缺鐵處理時(shí)具有相同的表型，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，為研究ILR3在生物體中的更多功能，奠定工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型為Col-0，突變體ilr3-2（Salk_004997C）購(gòu)買自網(wǎng)站https：//www.arabidopsis.org/，雙元表達(dá)載體pYAO-Cas9-SK由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所謝旗研究組饋贈(zèng)，大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） EHA105由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ購(gòu)自NEB（北京）公司，質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，T載體、DNA連接試劑盒、Taq DNA聚合酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，其他生化試劑及引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 擬南芥AtILR3編輯靶位點(diǎn)的確定

將擬南芥AtILR3基因（At5g54680）提交NCBI檢索，獲得其基因序列及外顯子序列信息，在外顯子區(qū)域?qū)ふ襊AM（protospacer adjacent motif）位點(diǎn)為“NGG”的23 bp序列，且該序列最好帶有酶切位點(diǎn)，并通過(guò)擬南芥bHLH家族各成員同源序列比對(duì)驗(yàn)證該靶位點(diǎn)的特異性。針對(duì)篩選到的靶位點(diǎn)，在序列5′端添加BsaⅠ限制性內(nèi)切酶的黏性末端接頭TGATT和AAAC，分別設(shè)計(jì)引物P1-F和P1-R（表1）。

1.3 gRNA的合成及與載體的連接

將10 μmol/L的P1-F和P1-R各取1 μL，加入到8 μL退火緩沖液（TE+50 mmol/L NaCl）中，混勻后在PCR儀中退火：從95 ℃緩慢降溫至 16 ℃，速率為0.1 ℃/s;取1 μL退火產(chǎn)物，與用 BsaⅠ 酶切過(guò)的載體pYAO-Cas9-SK進(jìn)行連接，體系如下：1 μL 退火產(chǎn)物，1 μL載體，1 μL 10×T4緩沖液，0.5 μL T4連接酶，加ddH2O至10 μL，連接條件為25 ℃反應(yīng)2 h。采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)篩選鑒定后測(cè)序。將測(cè)序正確質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。

1.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及基因編輯植株的獲得

采用浸花法對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化[12]，收集轉(zhuǎn)化后的T0代種子，干燥后，75%乙醇消毒1 min，10%次氯酸鈉消毒10 min，無(wú)菌水漂洗5次，均與播種于含潮霉素25 mg/L的1/2MS表面進(jìn)行抗性篩選，培養(yǎng)條件為22 ℃，16 h光照，8 h黑暗。

2周后，選取有潮霉素抗性的擬南芥幼苗，移栽至土壤基質(zhì)中生長(zhǎng)，同時(shí)摘取1張葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA，并以此DNA為模板，以潮霉素抗性基因序列設(shè)計(jì)引物HygR-F、HygR-R（表1），進(jìn)行PCR鑒定。PCR體系：在20 μL反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶1.0 U，dNTP各0.25 μmol/L，引物0.5 μmol/L，100 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次;72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)，能完整擴(kuò)增出潮霉素抗性基因的個(gè)體為轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株。T1、T2代擬南芥陽(yáng)性植株采用相同方法鑒定。

根據(jù)基因AtILR[STBX]3[STBZ]序列，在靶位點(diǎn)上下游200～300 bp處設(shè)計(jì)引物P2-F、P2-R（表1、圖1），以T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的基因組DNA為模板，再次進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系與程序與上述相同，擴(kuò)增產(chǎn)物為含靶位點(diǎn)的562 bp的片段。電泳后，回收目的片段，取其中一部分進(jìn)行限制性內(nèi)切酶處理。將未被切開的PCR片段克隆到T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并對(duì)插入片段進(jìn)行菌落PCR，陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取并測(cè)序。

1.5 AtILR3編輯擬南芥的表型分析

將擬南芥野生型、ilr3-2突變體及獲得的4個(gè)株系的ILR3編輯擬南芥T1代幼苗，播種于1/2MS、1/2MS-Fe和1/2MS-Fe+50 μmol/L菲洛嗪（ferrozine，F(xiàn)rz）培養(yǎng)基，2周后，拍照并統(tǒng)計(jì)最長(zhǎng)根長(zhǎng)度。

采用三引物法[13]對(duì)ilr[STBX]3-2[STBZ]突變體進(jìn)行鑒定，引物L(fēng)P、RP和LbB1.3位點(diǎn)及序列見圖1和表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtILR3編輯靶位點(diǎn)的篩選及載體構(gòu)建

序列分析結(jié)果表明，AtILR3基因包5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)全長(zhǎng)705 bp，根據(jù)CRISPR/Cas9 設(shè)計(jì)原理，選擇其第2個(gè)外顯子上的特異序列為編輯靶序列（圖1），并且該靶位點(diǎn)PAM序列前6 bp包含1個(gè)BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（GGATCC），方便檢測(cè)。

根據(jù)靶位點(diǎn)序列合成靶點(diǎn)接頭引物P1-F和P1-R，退火形成靶點(diǎn)接頭后克隆到CRISPR/Cas9 載體pYAO-Cas9-SK[8]，測(cè)序后將正確質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105。

2.2 擬南芥基因編輯植株的獲得及鑒定

利用引物HygR-F、HygR-R做PCR鑒定得到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗;利用P2-F、P2-R為引物，陽(yáng)性苗基因組DNA為模板，擴(kuò)增出含靶位點(diǎn)的DNA片段;回收此片段，用BamHⅠ酶切鑒定電泳后，獲得4株ILR3基因編輯擬南芥幼苗。如圖2-A所示，野生型的片段被BamHⅠ識(shí)別，并完全切斷為2個(gè)長(zhǎng)度分別為276 、286 bp的片段（由于2個(gè)片段大小過(guò)于接近，電泳結(jié)果只看到1條帶），而突變片段的擴(kuò)增產(chǎn)物則無(wú)法被識(shí)別和切割。

將未消化的PCR片段克隆到T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并將插入片段進(jìn)行菌落PCR，陽(yáng)性單菌落培養(yǎng)過(guò)夜后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明，在靶點(diǎn)位置發(fā)生不同類型的編輯，在PAM序列前3～7 bp分別產(chǎn)生了插入和缺失突變， 其中缺失突變占多數(shù)（圖2-B）。

2.3 AtILR3編輯擬南芥的表型

擬南芥ILR3蛋白在鐵動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，突變體在缺鐵環(huán)境中出現(xiàn)黃化、發(fā)育不良等表型[10-11]。將野生型、ilr[STBX]3-2[STBZ]純合突變體及篩選得到的4個(gè)基因編輯T1代幼苗播種于1/2MS、1/2MS-Fe和1/2MS-Fe+50 μmol/L Frz培養(yǎng)基，2周后發(fā)現(xiàn)，4個(gè)基因編輯株系的幼苗與ilr3-2突變體出現(xiàn)相同的表型，均弱于野生型（圖3-A）。數(shù)據(jù)顯示，在含有鐵元素的1/2 MS上，6個(gè)株系的擬南芥生長(zhǎng)狀況基本無(wú)差異;在缺鐵培養(yǎng)基上，野生型根系明顯增長(zhǎng)，由約1.8 cm增長(zhǎng)到約74 cm，而突變體ilr[STBX]3-2[STBZ]和4個(gè)基因編輯株系僅增長(zhǎng)到約2.7 cm;Frz可以螯合培養(yǎng)基中瓊脂中的微量鐵元素[14]，在1/2MS-Fe+50 μmol/L Frz 的培養(yǎng)基上，雖然ilr[STBX]3-2[STBZ]和基因編輯株系最長(zhǎng)根長(zhǎng)度影響不大，但側(cè)根減少，長(zhǎng)勢(shì)更弱，而野生型影響較?。▓D3-B）。

為鑒定T-DNA插入突變體ilr3-2是否為純合子，采用三引物法對(duì)10棵突變體單株和野生型進(jìn)行PCR鑒定。電泳結(jié)果（圖3-C）表明，可以證明所用突變體ilr3-2為純合子，以上表型數(shù)據(jù)可信。

3 討論

CRSPR/Cas9是一種高效且簡(jiǎn)便的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，該技術(shù)具有合成簡(jiǎn)單、周期短、操作靈活、效率高等優(yōu)點(diǎn)，給基因工程帶來(lái)技術(shù)性革命，在眾多植物基因編輯中已經(jīng)得到了成功應(yīng)用，如擬南芥[15]、水稻[16]、玉米[17]、小麥[18]、大豆[19]、矮牽牛[20]、巨桉[21]等。將這一技術(shù)應(yīng)用于擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，多采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法來(lái)進(jìn)行，因而囊胚是T-DNA的主要靶點(diǎn)[22]。35S和泛素啟動(dòng)子常用于驅(qū)動(dòng)Cas[STBX]9[STBZ]基因在擬南芥的中表達(dá)，前者應(yīng)用得更多。而已有的研究表明，CaMV 35S啟動(dòng)子在生殖細(xì)胞中活性極低，用CaMV 35S驅(qū)動(dòng)的Cas[STBX]9[STBZ]對(duì)擬南芥基因組的編輯效率明顯低于水稻，并且絕大多數(shù)T1植株只是體細(xì)胞突變，并不能遺傳到T2[23-24]。YAO是一個(gè)在細(xì)胞分裂旺盛組織優(yōu)先表達(dá)的基因，尤其在胚、胚囊、胚乳以及花粉中有很高的表達(dá)量[7];謝旗研究組用該基因的啟動(dòng)子pYAO代替35S啟動(dòng)子來(lái)啟動(dòng)Cas9的表達(dá)，提高了編輯效率并獲得生殖系突變，且編輯形式更多[8]。因此，本研究也利用啟動(dòng)子pYAO來(lái)驅(qū)動(dòng)Cas[STBX]9[STBZ]的表達(dá)，T0共獲得4株基因編輯擬南芥株系。為簡(jiǎn)化突變檢測(cè)過(guò)程，本研究選擇在PAM上游存在BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的序列作為靶位點(diǎn)。利用 BamHⅠ 進(jìn)行突變檢測(cè)和測(cè)序的結(jié)果顯示，4個(gè)株系中有3個(gè)為缺失突變，1個(gè)為插入突變，突變位點(diǎn)位于PAM上游3～7 bp處。由于本試驗(yàn)中只有不被BamHⅠ消化的PCR產(chǎn)物才會(huì)被收集鑒定，因此，存在雖然發(fā)生突變，但突變位點(diǎn)不在BamHⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)的可能，這樣的突變將不會(huì)被檢測(cè)到。因此本試驗(yàn)所檢測(cè)到的各突變類型的比例可能比真實(shí)的突變類型偏小，試驗(yàn)設(shè)計(jì)還有待進(jìn)一步完善。

擬南芥bHLH家族Ⅳc亞家族成員bHLH34/104/105/115是鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的主要因子，其中bLHLH105（ILR3）可與PYE[25]、BTS[25-27]、bHLH34[28]、bHLH104[10]、bHLH115[29]等蛋白協(xié)同作用，調(diào)控鐵吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)下游基因FIT、ZIF1、NAS4、FRO2/IRT1、bHLH38/39/100/101、MYB10/72[28]的表達(dá);ILR3還和PYE共同參與植物缺鐵脅迫下葡萄糖異硫氰酸鹽（glucosinolate，簡(jiǎn)稱GLS）積累的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11]。由此可知，ILR3基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵御脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。ILR3的T-DNA插入突變體ilr3-2已廣泛應(yīng)用在該基因功能的研究中。本研究發(fā)現(xiàn)，ILR3在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有新的功能，所以利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)ILR3基因進(jìn)行編輯。為確保突變后的基因完全失去功能，靶位點(diǎn)一般選擇在編碼區(qū)，尤其是靠近5′端或處于編碼蛋白功能區(qū)之前的序列[30]。因此，本研究選擇對(duì)ILR3基因第2個(gè)外顯子進(jìn)行編輯，共獲得4個(gè)突變株系，且這些株系在缺鐵情況下與 ilr[STBX]3-2[STBZ] 表現(xiàn)出相同的生長(zhǎng)狀態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了ILR3在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中及抗逆性方面所起的重要作用。

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收稿日期：2019-08-01

基金項(xiàng)目：上海市青年科技英才揚(yáng)帆計(jì)劃（編號(hào)：19YF1414800）。

作者簡(jiǎn)介：李 鵬（1983—），男，安徽濉溪人，碩士，工程師，主要從事植物抗逆性研究。E-mail：penglee98@163.com。