彭媛媛 肖星凝 朱龍佼 陶曉奇 許文濤

（1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

隨著市場經(jīng)濟(jì)的迅猛發(fā)展，人們生活水平的日益提高，全民健康意識(shí)也逐步提高。為了保障人民衣食住行各方面的安全，進(jìn)一步發(fā)展檢測分析技術(shù)顯得尤為重要?，F(xiàn)代社會(huì)的快節(jié)奏在一定程度上促使檢測技術(shù)的革新，建立精準(zhǔn)快速的方法檢測對(duì)人類健康和生態(tài)系統(tǒng)造成有害影響的污染物，已成為了各領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)［1］。適配體（Aptamer）是一類由幾十個(gè)核苷酸組成單鏈短序列，與傳統(tǒng)的抗體相比適配體對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)除了具有更高的敏感性和選擇性外，還存在能大規(guī)模生產(chǎn)、批次間變異小、貨架期長等諸多優(yōu)點(diǎn)。適配體經(jīng)修飾可進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性和靶向性，可作為抗體替代品用于檢測分析領(lǐng)域［2］。

適配體主要有單鏈脫氧核糖核酸（ssDNA）和核糖核酸（RNA）兩類［3］。適配體可通過鏈內(nèi)堿基間的氫鍵相互作用折疊形成諸如莖環(huán)、凸環(huán)、口袋和假結(jié)等二級(jí)結(jié)構(gòu)，而富G序列還可通過鳥嘌呤間的氫鍵相互作用，片層堆疊形成G-四鏈體和G-三鏈體結(jié)構(gòu)［4］，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)可集合形成獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行特異性識(shí)別。與抗原抗體結(jié)合的方式類似，適配體可結(jié)合金屬離子、化合物、蛋白質(zhì)、病毒、生物細(xì)胞和細(xì)菌等多種靶標(biāo)物質(zhì)［5］。

小分子靶標(biāo)物質(zhì)的分子量不超過500 Da，包括獸藥、農(nóng)藥、生物標(biāo)志物、環(huán)境污染物、內(nèi)源性代謝物及生物毒素等。與大分子物質(zhì)不同，分子量小的目標(biāo)物與寡核苷酸適配體的尺寸差異較大，使得小分子靶標(biāo)的適配體篩選分離的難度更大［6］。小分子靶標(biāo)物質(zhì)的痕量檢測在食品安全、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域均具有重要的意義，尤其是檢測重金屬、毒素和抗生素等可能對(duì)人體造成有害影響的小分子具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，小分子靶標(biāo)適配體的篩選總體成功率并不高［5］，故有必要根據(jù)小分子與適配體的相互作用規(guī)律，針對(duì)目標(biāo)物設(shè)計(jì)合理有效的檢測進(jìn)程，建立快速準(zhǔn)確檢測分析小分子靶標(biāo)的方法。因此，本文從靶標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)出發(fā)，梳理了近年來各類小分子靶標(biāo)與適配體的作用規(guī)律及作用方式，旨在為完善小分子分析檢測體系提供有益參考。

1 小分子物質(zhì)的分類及性質(zhì)

1.1 單質(zhì)

單質(zhì)的性質(zhì)往往與其元素的性質(zhì)相關(guān)，由金屬鍵結(jié)合而成的固態(tài)金屬晶體內(nèi)部存在游離電子，而原子則采取密堆積形式以保證晶體的穩(wěn)定。有研究表明金屬較易失去電子而帶正電荷，如鎘［7］、鋅［8］等。而非金屬單質(zhì)則往往帶負(fù)電，如砷（As）與帶負(fù)電的DNA之間存在一定程度的靜電排斥作用，砷的適配體（Ars-3）對(duì)As（III）的識(shí)別過程存在爭議［9］。

1.2 化合物

化合物可分為無機(jī)和有機(jī)兩大類。無機(jī)化合物大致可分為氧化物、鹽、酸、堿等，往往通過電離得到的離子與其他物質(zhì)相互作用，如氧化鋅通過Zn2+與DNA相互作用形成復(fù)合結(jié)構(gòu)［10］。根據(jù)有機(jī)化合物的碳骨架結(jié)構(gòu)差異可分為鏈狀化合物和環(huán)狀化合物。有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)中含有-OH、-CONH2的部分往往具有親水性，通常含有-NH2的結(jié)構(gòu)常帶正電，含基團(tuán)-COOH的部分則帶負(fù)電。這些結(jié)構(gòu)基團(tuán)共同影響著鏈狀化合物的性質(zhì)，如鏈狀結(jié)構(gòu)的L-瓜氨酸和L-精氨酸，其性質(zhì)由帶正電的氨基和帶負(fù)電的羧基共同決定［11］；而鏈狀化合物乙醇胺的功能特性，也受其結(jié)構(gòu)中羥基和氨基的影響［12］。

環(huán)狀化合物可分為碳環(huán)化合物和雜環(huán)化合物，其性質(zhì)往往受到帶電基團(tuán)及其所含環(huán)狀結(jié)構(gòu)的影響。根據(jù)結(jié)構(gòu)中是否含有芳香環(huán)，碳環(huán)化合物可分為芳香族和脂環(huán)族，雜環(huán)化合物可包括芳雜環(huán)和脂雜環(huán)。與碳環(huán)化合物不同，雜環(huán)化合物往往包含由碳原子和其他原子（如氧、氮、硫等）形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。雜環(huán)化合物是迄今為止數(shù)目最龐大的一類有機(jī)化合物，這些雜環(huán)結(jié)構(gòu)廣泛存在于各種具有生物活性的天然產(chǎn)物、有機(jī)材料、農(nóng)藥和藥品中［13］。常見的脂雜環(huán)小分子化合物有：麥芽糖、鳥嘌呤、茶堿和鏈霉素等。芳雜環(huán)類有多巴胺、可卡因、氯霉素和四環(huán)素等［11］。

2 小分子與適配體的作用規(guī)律

適配體能在識(shí)別靶標(biāo)的同時(shí)鑒別這些小分子間極其微小的結(jié)構(gòu)差異，這種高特異性識(shí)別過程與適配體和靶標(biāo)的相互作用形式有關(guān)，包括帶電基團(tuán)和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)等。例如，L-酪氨酸的RNA適配體（dopa2）能分辨靶標(biāo)帶電荷基團(tuán)的差異，而對(duì)芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的識(shí)別沒有特異性，故dopa2對(duì)L-多巴胺（其芳香環(huán)結(jié)構(gòu)與L-酪氨酸相近）有高親和力，但對(duì)缺少羧基的多巴胺的親和降低力約10倍［14］。當(dāng)靶標(biāo)分子既沒有平面芳香環(huán)、也沒有帶電荷的功能基團(tuán)時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生一種與常見內(nèi)部凸環(huán)和發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，如與生物素結(jié)合的適配體具有獨(dú)特的假結(jié)折疊結(jié)構(gòu)（圖1），這種新型識(shí)別方式可能是由靶標(biāo)的自然屬性所致［15］。

圖1 生物素適配體的假結(jié)折疊結(jié)構(gòu)［15］

小分子往往通過疏水和靜電相互作用、氫鍵和堿基堆積等作用力結(jié)合適配體［16］。金屬類小分子靶標(biāo)往往會(huì)“鑲嵌”在適配體鏈上，而小分子化合物則會(huì)被“條網(wǎng)狀”的適配體鏈段兜住。小分子與適配體的鍵合方式主要是非共價(jià)結(jié)合，包括靜電結(jié)合、溝面結(jié)合、插入作用和嵌入作用［17］。如圖2所示，靜電作用是指小分子物質(zhì)中帶正電的部分通過靜電相互作用與核酸分子骨架中帶負(fù)電的基團(tuán)鍵合的過程。溝面結(jié)合是指分子與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中小溝或大溝的堿基對(duì)邊緣發(fā)生相互作用的過程，構(gòu)型體積較小的化合物主要沿著小溝方向與核酸結(jié)合，氫鍵以及堿基的疏水性均能推動(dòng)兩者的鍵合。插入結(jié)合是指小分子的共軛芳香環(huán)平面插入核酸雙鏈（RNA局部雙鏈或DNA雙螺旋）堿基對(duì)的過程，相鄰堿基間的范德華力、疏水作用和π-π電子堆積均能穩(wěn)定結(jié)合構(gòu)象。嵌入結(jié)合是指小分子借助氫鍵和范德華力替代DNA小溝處的錯(cuò)配堿基并與相應(yīng)的堿基產(chǎn)生π-π堆積作用的過程?？傊?，與靜電結(jié)合與溝面結(jié)合相比，插入結(jié)合和嵌入結(jié)合的鍵合方式相對(duì)較強(qiáng)；嵌入結(jié)合與插入結(jié)合的形式相近，但嵌入結(jié)合的相互作用更強(qiáng)。

圖2 小分子與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的鍵合方式［18］

靶標(biāo)分子往往存在多個(gè)與之特異性結(jié)合的適配體，而適配體序列長短及堿基組成均決定了其間的結(jié)構(gòu)差異。經(jīng)SELEX技術(shù)篩選得到的適配體往往含有部分冗長序列，可結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)，在保留適配體與靶標(biāo)結(jié)合區(qū)域完整的同時(shí)截?cái)喽嘤嗳唛L序列。有研究表明，適配體識(shí)別靶標(biāo)的區(qū)域具有較為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、三通連接和G-四鏈體結(jié)構(gòu)等［19］。對(duì)于某些由嘌呤和嘧啶堿基交替排列呈莖環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)的適配體而言，莖部序列在某種程度上能對(duì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到一定的作用，有研究成功通過延長莖部序列長度穩(wěn)定核酸構(gòu)象［20］。三通連接結(jié)構(gòu)的適配體則是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)并折疊形成合適的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在三通連接處形成“空腔”利用疏水作用與靶標(biāo)（如可卡因、膽酸等）結(jié)合，而非借助極性功能基團(tuán)識(shí)別靶標(biāo)［21］。G-四鏈體結(jié)構(gòu)由4條富含鳥嘌呤的鏈段形成的支架和幾個(gè)在靶標(biāo)識(shí)別過程中起作用的環(huán)狀基序組成，該結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)間存在較強(qiáng)的疏水結(jié)合能力，故OTA、核仁素、氯化血紅素和熒光素等靶標(biāo)物質(zhì)的適配體往往呈G-四鏈體結(jié)構(gòu)［22-23］。

3 小分子與適配體相互作用的分析方法

研究靶標(biāo)小分子與核酸相互作用的方法主要包括兩大類，一類是較為直觀地分析微觀結(jié)構(gòu)變化，如透射電子顯微鏡、選區(qū)電子衍射、X-射線晶體衍射、掃描隧道顯微鏡、原子力顯微鏡等［24-25］；另一類方法在相互作用的研究過程中更為普遍，主要是借助圖譜、物質(zhì)性質(zhì)變化來間接分析體系的相互作用。寡核苷酸適配體作為核酸的一部分，亦可借鑒這些方法分析其與小分子的相互作用。

3.1 借助圖譜的分析

常見的用于分析相互作用的圖譜有紫外-可見光吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、拉曼散射光譜、圓二色譜和核磁共振波譜。借助吸收光譜和發(fā)射光譜可以推斷小分子靶標(biāo)與核酸適配體間的相互作用模式以及結(jié)合強(qiáng)度。兩者的相互作用會(huì)促使靶標(biāo)紫外-可見光吸收光譜的波長和強(qiáng)度發(fā)生變化，且作用力往往與吸收光譜的紅移程度和減色率呈正比［26］，若靶標(biāo)分子與核酸以相對(duì)較弱的靜電結(jié)合方式鍵合，吸收光譜的特征峰則無明顯變化。而一些有熒光特性的染料小分子通過溝面或插入結(jié)合適配體，在熒光發(fā)射光譜中會(huì)出現(xiàn)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象［27］。借助拉曼散射光譜則能得到分子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變（包括振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)）的相關(guān)信息，據(jù)此有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的Cd2+會(huì)促使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的部分堿基堆疊坍塌、氫鍵斷裂［28］。借助圓二色譜并結(jié)合透析實(shí)驗(yàn)可推斷小分子物質(zhì)與核酸的鍵合方式，通過對(duì)比復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)偏振光的吸收程度可判斷小分子對(duì)DNA螺旋軸的取向及其立體選擇性。借助核磁共振波譜可分析小分子物質(zhì)與核酸的結(jié)合區(qū)域，由于不同位置的氫原子在共振狀態(tài)中所吸收的電磁波頻率不同，故小分子的氫化學(xué)位移與核酸堿基中的質(zhì)子化學(xué)位移值重疊處即是兩者的親和位點(diǎn)［26］。

3.2 借助性質(zhì)的改變

當(dāng)晶體結(jié)構(gòu)等參數(shù)缺乏、紫外吸收光譜和熒光光譜的變化均不明顯時(shí)，可借助凝膠電泳、流體力學(xué)、解旋溫度差異以及分子的電活性等，分析推斷小分子化合物與核酸的相互作用模式與結(jié)合強(qiáng)度。瓊脂糖凝膠電泳的條帶位置反映了核酸片段的大小差異，借此能初步判斷小分子與其是否存在一定的相互作用：若兩者間僅是靜電結(jié)合，那么電泳遷移率的變化不大；而插入結(jié)合的模式則會(huì)使得復(fù)合結(jié)構(gòu)的電泳遷移率減慢。流體力學(xué)中復(fù)合體系黏度的變化反映了核酸片段長度的差異：若小分子以插入結(jié)合的方式與核酸作用，整個(gè)片段長度增加體系黏度增大［29］；若是不完全插入結(jié)合小分子的部分嵌入會(huì)使原有DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)更加扭結(jié)，復(fù)合體系黏度減?。欢遣迦虢Y(jié)合（如靜電結(jié)合、溝面結(jié)合）的模式則對(duì)體系的黏度的影響不大［30］。還可借助DNA雙鏈的解旋溫度判斷小分子與DNA的相互作用模式：小分子的插入結(jié)合模式會(huì)在一定程度上抑制DNA雙鏈的解旋，從而導(dǎo)致解旋溫度升高；分子的嵌入結(jié)合模式會(huì)引起堿基翻轉(zhuǎn)錯(cuò)位，致使原有核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，解旋溫度降低。伏安特性的變化也能反映核酸的構(gòu)象，且電勢差與半波電位的差異則能體現(xiàn)小分子物質(zhì)與核酸的結(jié)合方式［31］。

4 小分子靶標(biāo)與適配體相互作用的類型

理論上，任一小分子靶標(biāo)物質(zhì)均能從RNA和DNA文庫中篩選分離得到適配體。RNA具有的模塊化性質(zhì)使其能夠形成獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，并自動(dòng)折疊呈“口袋”，同時(shí)保持對(duì)小分子靶標(biāo)的結(jié)合特性。由于DNA缺少RNA所具有的2'-羥基，篩選出的RNA和DNA適配體往往具有明顯不同的序列和折疊結(jié)構(gòu)［11］。但也存在與靶標(biāo)分子結(jié)合的DNA和RNA適配體具有相同序列（堿基T在RNA序列中替換為U）的報(bào)道：這兩條適配體均形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，并以較低的親和力與核黃素結(jié)合［32］。

4.1 金屬類小分子靶標(biāo)

4.1.1 與核酸嘧啶基團(tuán)作用 帶正電的金屬小分子往往與其適配體的嘧啶基團(tuán)中帶負(fù)電的部分結(jié)合。不同金屬的適配體往往具有不同的結(jié)構(gòu)，如Cd（Ⅱ）、Zn2+和 Pd2+的適配體呈莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，靶標(biāo)分子通過配位鍵結(jié)合適配體環(huán)狀部分，而莖狀部分堿基對(duì)則利用氫鍵起到一定的穩(wěn)定作用［7，33］。金屬氧化物ZnO與適配體Poly-d（T）30的鍵合過程是：Zn2+利用氫鍵和靜電相互作用規(guī)則性的結(jié)合于DNA分子胸腺嘧啶堿基間，依次堆積逐漸形成晶體狀ZnO納米殼層［25］。

4.1.2 與核酸嘌呤基團(tuán)作用 在靶標(biāo)與其適配體的結(jié)合過程常會(huì)受到體系中金屬離子的影響，如Mg2+的存在可增強(qiáng)赭曲霉毒素A與其適配體間的相互作用，由于赭曲霉毒素A的適配體富含鳥嘌呤，K+也可通過與鳥嘌呤O6的靜電作用，進(jìn)一步誘導(dǎo)其G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成并起到一定的穩(wěn)定作用［34］。而Ag+則能螯合鳥嘌呤堿基中的N7和C6O基團(tuán)，破壞原有的G-四鏈體結(jié)構(gòu)［35］。

4.2 化合物類小分子靶標(biāo)

4.2.1 由靶標(biāo)的帶電基團(tuán)主導(dǎo) 帶電基團(tuán)在一定程度上會(huì)影響適配體與靶標(biāo)間的相互作用，氨基酸類小分子主要借助氨基和羧基與適配體結(jié)合，羥基起到一定的輔助作用［11］。RNA適配體通常圍繞氨基酸折疊，通過氫鍵識(shí)別靶標(biāo)分子［36］，如谷氨酸尿素部分帶負(fù)電荷的氧原子與尿嘧啶的N3之間通過氫鍵作用；而精氨酸帶正電的氨基，則作為氫鍵的供體與胞嘧啶作用［37］。

糖類小分子與適配體的相互作用主要依賴于氫鍵和疏水作用，其中氫鍵由糖苷類化合物（如麥芽糖、阿拉伯糖等）吡喃環(huán)中的氧與羥基形成，由于帶電基團(tuán)和芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的缺乏，以羥基結(jié)構(gòu)為主的糖類小分子與其適配體的親和力并不太強(qiáng)［11］。Masud等［38］研究表明在適配體胸腺嘧啶核苷C5處修飾質(zhì)子化的氨基陽離子，可增強(qiáng)其與唾液酸化乳糖（含有帶負(fù)電的羧基）的親和力，并以此推測該適配體為三通連接結(jié)構(gòu)，其莖部區(qū)域含有經(jīng)修飾的胸腺嘧啶核苷。不同的適配體的特異性結(jié)合區(qū)域存在差異，Yang等［39］測試了DNA適配體對(duì)寡糖基序的選擇性識(shí)別能力，發(fā)現(xiàn)其能夠辨別大分子表面糖蛋白修飾的微小差異；而Srisawat等［40］篩選出葡聚糖G-100的RNA適配體，推測其最小識(shí)別位點(diǎn)是由4個(gè)以上葡萄糖殘基通過α-1，6-糖苷鍵相連而成。

還有部分天然產(chǎn)物也同樣借助氫鍵與疏水作用結(jié)合適配體。Zimmermann等［41］利用核磁共振波譜推斷了茶堿-RNA適配體的復(fù)合結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明適配體利用復(fù)雜的氫鍵網(wǎng)絡(luò)和堆疊相互作用“包裹”茶堿，兩者的特異性識(shí)別取決于多個(gè)接觸位點(diǎn)，咖啡因N7位置比茶堿多一個(gè)甲基，該甲基所致的空間排斥在一定程度上會(huì)削弱氫鍵作用，這也是茶堿適配體對(duì)咖啡因親和性極低的原因。Stojanovic等［42］篩選了可卡因的DNA適配體并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測，結(jié)果表明在其三通連接處具有親脂性。Kato等［43］則發(fā)現(xiàn)膽酸的單鏈DNA適配體也表現(xiàn)為三通連接結(jié)構(gòu)，其形成的“空腔”可經(jīng)疏水作用結(jié)合靶標(biāo)。有研究表明甾族化合物（又稱類固醇，如膽酸）的適配體不是通過極性功能基團(tuán)特異性識(shí)別靶標(biāo)，而是通過折疊成合適的二級(jí)結(jié)構(gòu)來識(shí)別大小形狀不同的靶標(biāo)分子［21］。

4.2.2 由靶標(biāo)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)主導(dǎo) 適配體主要通過腺苷和核糖結(jié)構(gòu)識(shí)別核酸類小分子，其特異性受空間作用的影響［11］。例如，最初篩得ATP的DNA適配體主要識(shí)別靶標(biāo)的堿基和糖，5'-磷酸基團(tuán)不參與結(jié)合；隨著篩選思路地轉(zhuǎn)換，也得到了強(qiáng)烈作用于ATP的β-和γ-磷酸基團(tuán)的新型RNA適配體［44］。部分輔助因子類小分子與適配體的結(jié)合也與環(huán)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，如S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、輔酶A的腺苷部分與其RNA適配體結(jié)合［11］，黃素嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）則是通過其結(jié)構(gòu)中的異咯嗪母核與其適配體作用［45］。

染料類小分子噻唑橙可與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNA適配體形成復(fù)合物并產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，而溴化乙錠的三環(huán)平面基團(tuán)亦可插入結(jié)合于DNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)構(gòu)的堆積堿基中產(chǎn)生熒光。RNA適配體往往以“結(jié)合口袋”的形式識(shí)別染料小分子，識(shí)別過程主要受到堿基堆積和形態(tài)互補(bǔ)的推動(dòng)?？兹甘G的適配體借助A30堿基卡住MG的外苯環(huán)以形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)，其結(jié)合位點(diǎn)呈不對(duì)稱內(nèi)部凸環(huán)，兩側(cè)經(jīng)互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)［46-47］。熒光染料DFHBI結(jié)合于RNA適配體的G4-鏈體結(jié)構(gòu)中，未成對(duì)的鳥嘌呤殘基將DFHBI卡住，使其兩個(gè)芳香環(huán)在同一個(gè)平面形成熒光構(gòu)象［48］。

4.2.3 多種相互作用共同決定 如圖3所示，還有一些小分子化合物與適配體的相互作用由帶電基團(tuán)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)共同介導(dǎo)，包括四環(huán)素、鏈霉素、氯霉素及紫霉素等抗生素類靶標(biāo)。由4個(gè)環(huán)組成的四環(huán)素平面結(jié)構(gòu)，一側(cè)具有的親水功能基團(tuán)能形成離子相互作用；另一側(cè)則作為疏水面存在非極性和堆積作用。Berens等［49］通過鉛剪切和硫酸二甲酯（Dimethylsulfate，DMS）修飾實(shí)驗(yàn)分析了RNA適配體與四環(huán)素結(jié)合后的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，并構(gòu)建四環(huán)素最小適配體cb28的最簡二級(jí)結(jié)構(gòu)圖，推斷出cb28結(jié)構(gòu)中L3的G39可能是兩者結(jié)合位點(diǎn)，而四環(huán)素的6位羥基是兩者相互識(shí)別的關(guān)鍵。氨基糖苷類抗生素的基本構(gòu)件是2-脫氧鏈霉胺，其多樣性取決于糖環(huán)上的羥基、甲基和羥甲基，其適配體呈莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，莖部常存在小的內(nèi)環(huán)或單個(gè)核苷酸的凸起，主要帶負(fù)電荷的環(huán)狀結(jié)構(gòu)則作為結(jié)合“口袋”結(jié)合帶正電荷的氨基糖苷類化合物［11］。氯霉素由芳香族氨基酸（苯丙氨酸等）的生物合成途徑中衍生而來的，其RNA適配體由3個(gè)螺旋組成，中間被兩個(gè)不對(duì)稱的凸環(huán)（一側(cè)是單個(gè)的腺苷酸，另一側(cè)含4-6個(gè)腺嘌呤）隔斷［50］。鏈霉素是含有胍基的氨基環(huán)醇糖苷類抗生素，Tereshko等［51］通過對(duì)鏈霉素與適配體的復(fù)合物進(jìn)行X射線晶體結(jié)構(gòu)的高分辨解析，發(fā)現(xiàn)適配體呈L型結(jié)構(gòu)，L型的每個(gè)臂上的兩個(gè)環(huán)形成一個(gè)口袋將鏈霉素夾在其中，并通過堿基邊緣與其接觸。紫霉素是由6個(gè)氨基酸組成的堿性肽，其核心結(jié)構(gòu)是一個(gè)十六元環(huán)，Wallis等［52］發(fā)現(xiàn)篩選得到的紫霉素RNA適配體大部分含有由14個(gè)核苷酸組成的高度保守區(qū)，莖環(huán)狀的適配體通過“假結(jié)”（環(huán)部序列與其鄰近序列的堿基配對(duì)形成類似“打結(jié)”形狀）識(shí)別紫霉素。

圖3 部分抗生素類靶標(biāo)與其適配體的結(jié)構(gòu)［11］

5 應(yīng)用

所謂“磨刀不誤砍柴工”，小分子靶標(biāo)與適配體相互作用的研究必不可少。這一階段的準(zhǔn)確探索奠定了后續(xù)改性修飾適配體并將其應(yīng)用于實(shí)際的基礎(chǔ)，同時(shí)又印證了前期適配體篩選過程的準(zhǔn)確性和有效性。

5.1 適配體的篩選

了解小分子靶標(biāo)與適配體的相互作用形式及其結(jié)合位點(diǎn)，能在一定程度上使得核酸文庫序列設(shè)計(jì)更有效，同時(shí)還可根據(jù)已知結(jié)合位點(diǎn)推測靶標(biāo)結(jié)構(gòu)類似物的適配體序列，而進(jìn)一步比對(duì)不同基團(tuán)間的相互作用，明確適配體的特異性，避免該適配體在后續(xù)應(yīng)用中出現(xiàn)的交叉反應(yīng)。金屬類小分子在適配體篩選過程中往往能起到一定的輔助作用，有研究采用NaCl濃度梯度富集精氨酸適配體，而篩選L-異亮氨酸適配體的過程也需要Zn2+參與，這可能是因?yàn)楫惲涟彼釙?huì)與Zn2+結(jié)合或者適配體含有“Zn2+的RNA結(jié)構(gòu)”［11］。緩沖液體系中的金屬離子種類不同，篩得適配體也不同，在篩選維生素B12的適配體時(shí)選用含有Li+和Mg2+的緩沖液，所得的適配體依賴于高濃度的Li+，但結(jié)合時(shí)不需要Mg2+存在，當(dāng)用Na+替代Li+用于篩選時(shí)，所得的適配體不再依賴Li+，而是強(qiáng)烈依賴Mg2+［11］。

5.2 生物傳感器的搭建

了解小分子靶標(biāo)與適配體的相互作用形式及作用位點(diǎn)，有利于搭建精準(zhǔn)高效的生物傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量檢測，而借助生物傳感器的信號(hào)變化亦能推測核酸自身的堿基錯(cuò)配及靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)。有學(xué)者基于適配體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換功能搭建了3類熒光生物傳感器，包括分子信標(biāo)、分裂適配體傳感器、應(yīng)變位移傳感器［53］。這些傳感器均涉及到明確靶標(biāo)與適配體的結(jié)合位點(diǎn)，使得兩者在結(jié)合態(tài)和游離態(tài)之間處于最佳熱力學(xué)平衡。而確定最佳位點(diǎn)及作用堿基數(shù)，往往需要通過大量的序列設(shè)計(jì)和重復(fù)試驗(yàn)。而復(fù)合體系中的金屬離子也會(huì)影響適配體與小分子靶標(biāo)的結(jié)合，如Mg2+與四環(huán)素的酮和烯醇基團(tuán)配位是其與cb28適配體結(jié)合的關(guān)鍵［49］；而在鏈霉素適配體也需在Mg2+存在下才能結(jié)合鏈霉素［51］。故通過一定的技術(shù)手段準(zhǔn)確了解小分子與適配體之間的作用方式就顯得至關(guān)重要，同時(shí)也為上述生物傳感器的順利搭建起到了一定的積極意義。

6 總結(jié)與展望

小分子與核酸的鍵合方式主要有共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合，與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不同，單鏈適配體與小分子的相互作用幾乎是非共價(jià)結(jié)合，且兩者間“溝面結(jié)合”較少。適配體傾向于經(jīng)堿基互補(bǔ)配對(duì)折疊形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并纏繞靶標(biāo)小分子，使其以“插入結(jié)合”和“嵌入結(jié)合”的形式嵌入適配體結(jié)構(gòu)中。小分子化合物往往通過其帶電的基團(tuán)與適配體形成氫鍵，且兩者間還存在疏水和靜電相互作用。當(dāng)小分子結(jié)構(gòu)中含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)時(shí)，除了帶電基團(tuán)的影響，由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)自身的空間位阻作用，使得體系中往往存在堿基堆積效應(yīng)。帶正電的金屬離子通常與適配體嘧啶基團(tuán)上帶負(fù)電的結(jié)構(gòu)作用，金屬離子在一定程度上能調(diào)控適配體的構(gòu)象控制G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成與坍塌，亦能調(diào)控靶標(biāo)與適配體的結(jié)合能力，如Mg2+能控制四環(huán)素和鏈霉素結(jié)合其RNA適配體。總之，小分子物質(zhì)的自身結(jié)構(gòu)特性是影響適配體與其結(jié)合的關(guān)鍵，鏈狀適配體通常圍繞靶標(biāo)小分子纏繞折疊，結(jié)合位點(diǎn)附近堿基的帶電基團(tuán)使其穩(wěn)定，非結(jié)合位點(diǎn)的序列則往往利用堿基互補(bǔ)配對(duì)呈“莖稈”狀穩(wěn)定整個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)。

結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，物質(zhì)的性質(zhì)又影響其功能特性，準(zhǔn)確把握小分子物質(zhì)與適配體的鍵合方式與結(jié)合位點(diǎn)，探究小分子物質(zhì)與適配體的復(fù)合結(jié)構(gòu)是適配體應(yīng)用與發(fā)展的基礎(chǔ)。但影響適配體折疊的因素有很多，包括pH值、離子強(qiáng)度、陽離子種類等。目前缺少非常靈敏的監(jiān)測核酸適配體結(jié)構(gòu)變化的手段，適配體結(jié)構(gòu)的柔性使得其與靶標(biāo)間較難形成晶體結(jié)構(gòu)，使得X-ray晶體衍射的檢測適配體結(jié)構(gòu)信息變得困難，而基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的缺乏，往往使得從結(jié)構(gòu)和功能的角度分析問題的過程變得困難［54］。近年來，研究者們主要利用小分子物質(zhì)與適配體性質(zhì)的改變，結(jié)合各類圖譜分析，推斷兩者間可能存在的結(jié)合方式。分類整合已有小分子物質(zhì)與適配體的復(fù)合結(jié)構(gòu)信息，針對(duì)可能存在的性質(zhì)變化擬定標(biāo)準(zhǔn)化測定分析過程是未來的發(fā)展趨勢。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，新型檢測模式的深入研究，結(jié)合各項(xiàng)新技術(shù)建立新型適配體結(jié)構(gòu)功能分析體系指日可待。